材料和试剂

一次性杯，100ml，PP（聚丙烯）（SARSTEDT，目录号：75.562.105）
注意：它用于储存细胞沉淀。
70毫升聚碳酸酯超速离心管
C43（DE3）（Lucigen，目录号：60446）
PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶（Agilent Technologies，目录号：600670）
LB肉汤粉（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1377）
聚丙二醇P2000（Sigma-Aldrich，目录号：81380）
Gistex ® LS Ferm - 酵母提取物（Fermia AB，Sweden）
甘油（VWR，目录号：24388.295）
异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Biosynth，目录号：I-8000）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4509）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
溴苯酚蓝（Thermo Fisher Scientific，Fisher科学，目录号：BP115-25）
Penta·他的HRP共轭试剂盒（QIAGEN，目录号：34460）
注意：这是针对His标签的抗体，我们将其用于6x His标记的MgtA的Western印迹分析。该抗体与辣根过氧化物酶（HRP）结合，因此不需要使用二抗。
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
硫酸钾（K 2 O 3 SO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9458）
脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
苯基甲基磺酰氟（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
十二烷基-β-D麦芽糖苷（化学点，目录号：CP69227-93-6-BULK）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：56750）
二硫苏糖醇（Biosynth，目录号：D-8200）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221473）
Trizma ®基础（生物技术性能认证）（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
PageRuler TM 预饱和蛋白梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：26616）
LB肉汤（见食谱）
LB卡那霉素板（参见食谱）
成长媒介（见食谱）
1x SDS-PAGE加载缓冲液（参见食谱）
缓冲液A（参见食谱）
缓冲液B（参见食谱）
缓冲区C（见配方）
缓冲区D（见配方）
缓冲液E（参见食谱）

设备

孵化器
带底的锥形瓶（500毫升）（Saveen＆amp; Werner，目录号：00125-54）
注意：这些烧瓶有四个挡板（导流脊）。它打破介质的循环流动并增加其气体交换表面，从而与正常的锥形瓶相比增加了培养基的氧合。
带螺帽的瓶子，用于发酵（Saveen＆amp; Werner，目录号：88-2L）
LEX（大规模表达）48生物反应器系统（Epiphyte Three，Harbinger Biotechnology and engineering，model：LEX-48 Bioreactor）
高压匀浆器（用于裂解细胞）（Avestin，型号：EmulsiFlex C3）
Potter-Elvehjem型组织匀浆器（30ml）（WHEATON，目录号：358049）
70毫升聚碳酸酯超速离心管总成（Beckman Coulter，目录号：355622）
45 Ti转子（Beckman Coulter，目录号：339160）
Optima TM XE（Beckman Coulter，目录号：A99833）
色谱柱HP Histrap，5 ml（GE Healthcare，目录号：17-5248-02）
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg色谱柱（GE Healthcare，目录号：28-9893-35）
Vivaspin 20 MWCO 50,00 PES（Saveen＆amp; Werner，目录号：VS2032）

软件

Image Lab TM 软件
UNICORN软件与ÄKTA净化器相关

程序

过度表达MgtA
从E扩增 mgtA 基因。使用PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶与前述的引物（Subramani等人，2016），使用大肠杆菌DH5α基因组DNA。按照PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶手册的建议进行反应混合物和PCR条件。将扩增的基因插入pETM11载体（EMBL）中的NcoI和XhoI 限制性位点之间。因此，表达的MgtA将包括6x His标签，随后是N-末端的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶位点。
1. 将pETM11（mgtA ）质粒转化到C43（DE3）感受态细胞中，并在LB卡那霉素平板上平板，并在37℃下孵育16小时。
2. 随机选择5个菌落，并接种在含有200μg含有50μg/ ml卡那霉素的LB培养基的500ml带挡板底锥形瓶中。将烧瓶在37℃下以150rpm培养16小时
3. 对于C43（DE3）细胞中MgtA的大规模过表达，我们使用LEX 48生物反应器系统（Harbinger Technology LEX TM ）。
  注意：LEX系统通过穿过螺旋盖的喷雾器提供过滤的压缩空气。它提供了螺旋盖瓶中的细菌培养物的通气和混合。将培养瓶置于温度控制的水浴中，LEX 48可容纳24×2L标准螺帽。通常只有75％的瓶容量用于避免曝气过程中的介质溢出。
4. 将1％的过夜培养物接种到含有1.5L生长培养基，50μg/ ml卡那霉素和1.5ml聚丙二醇（PPG）P2000（消泡剂）的2L螺帽中。
5. 将瓶子放在Lex 48生物反应器水浴中。将水浴的温度设置在37°C，并启动通过分布器的气流。
6. 每小时测量600nm（OD 600）的光密度。消泡剂PPG P2000在这些条件下变得浑浊，并且可以在冰中孵育5分钟后清除。因此，在OD 600测量之前，从2L瓶中取出1ml培养物，并在冰上孵育5分钟。
7. 当OD 600小于0.6-2时，停止气流，并通过加冰将水浴冷却至17℃。将培养瓶放在17°C 30分钟以确保细菌培养物的等温。为了通过蛋白质印迹检查水平的过度表达（参见步骤12），将1ml细胞培养物沉淀在12,000xg，4℃，并标记为S （未诱导）。
8. 向每个瓶中加入1mM IPTG和另外1.5ml PPG P2000。开始气流，并将气瓶在17°C下放置16小时并连续流动。
9. 要终止诱导，将培养瓶转移到冰上。从12000xg，4℃的每个瓶中取出1ml细菌培养物，并标记为SⅠ（诱导）用于Western印迹分析。
10. 在4℃将细胞培养物以7,000xg离心20分钟，将得到的细胞沉淀物分成50g等分试样置于100ml一次性杯中，并储存在-20℃直到进一步使用。 br />
11. 在1×SDS-PAGE加载缓冲液中悬浮S UI 和S 样品小瓶以将OD 600标准化至10并在室温下孵育5分钟。在4℃下以20,000×g离心裂解的细胞20分钟。对于蛋白质印迹分析，使用10μl上清液，并对Penta·His HRP缀合的抗体进行印迹，以检测MgtA过表达。
  注意：通过蛋白质印迹确认MgtA过表达在他开始使用蛋白质纯化过程之前，高度推荐他的HRP抗体，因为在纯化过程中使用的洗涤剂是昂贵的，并且在此阶段可以确定与过表达相关的任何问题。不要煮沸用于SDS-PAGE和Western印迹分析的样品。
细胞溶解和增溶
1. 将冰冻的细胞沉淀物在冰上解冻，并以1:10（wt / vol）比例悬浮在缓冲液A中
2. 使用EmulsiFlex-C3（高压均质器（HPH））通过在11,000psi下通过细胞悬浮液三次来裂解细胞。除非另有说明，否则始终将样品存放在冰上。
  注意：我们没有测试其他裂解方法，如超声处理和搅拌器。但我们相信，也可以使用它们。预期蛋白质产量将根据裂解方法而有所不同。
3. 在4℃下将细胞裂解物以20,000 x g离心20分钟以除去未分解的细胞和包涵体。
4. 收集上清液，并在4℃下以100,000×g离心2小时以使内膜和外膜（混合膜）沉淀。
  注意：该步骤需要超速离心机，根据样品的体积选择转子和管。例如，如果样品尺寸为70ml，则可以使用45Ti转子和70ml聚碳酸酯超速离心管，其中可以使用超离心机OptimaXE。重要的是将用于超速离心的管子填充到管的颈部，在管的液体和帽之间可能没有间隙，以避免在离心过程中管内爆。
5. 使用Potter-Elvehjem型组织匀浆器将所得的混合膜沉淀物悬浮在缓冲液B中，10次。使用1:10（wt / vol）混合膜缓冲B比。在将所需量的缓冲液B加入到膜片中之前，取出10 ml溶解洗涤剂注意：膜悬浮液可以用液氮快速冷冻，如果不立即使用，储存在-80℃。
6. 我们使用1％β-十二烷基麦芽糖苷（β-DDM）来溶解膜蛋白。称取所需量的洗涤剂粉末并溶解在预留的10ml缓冲液B中
7. 将溶解的β-DDM滴加到混合膜悬浮液中，同时以4℃的转速150rpm搅拌。悬浮液在4℃下再搅拌60分钟。
MgtA的净化
1. 在使用前，用5柱体积（CV）的脱气MQ水洗涤Histrap HP 5 ml柱，并用10 CV缓冲液C平衡。
2. 向步骤B7中制备的样品中加入20 mM咪唑（pH 7.6），并以2 ml / min的速度装载到Histrap柱上。
3. 加载溶解的膜样品后，用10 CV缓冲液C和3 CV的15％缓冲液D以3ml / min洗涤Histrap柱。我们观察到一个小峰（图1A，峰1），同时用15％缓冲液D洗涤
4. 通过以3ml / min通过50％缓冲液D从Histrap柱洗脱MgtA。我们观察到一个相对较大的峰（图1A，峰2），同时用缓冲液D洗涤
5. 从每个级分取5μl样品，并用12％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳
6. 我们观察到，峰1含有一小部分MgtA以及其他杂质，而峰2含有＆gt; 80％纯MgtA，通过SDS-PAGE评估（图1A）
7. 将相应于峰2的级分收集，并使用vivaspin 20（具有50kDa截止值的蛋白质浓缩器）浓缩至6mg / ml。
8. 在浓缩级分时，通过用1.5 CV的脱气MQ和1.5 CV缓冲液E以0.5ml / min洗涤，制备连接到ÄKTA净化器的HiLoad 16/600 Superdex 200pg柱。
9. 在HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱上以0.5 ml / min的速度加入1 ml浓缩的MgtA（6 mg / ml），并通过1.5 CV缓冲液E.
10. 我们观察到空隙体积（44ml）处的小峰，然后在〜55ml处存在主要单分散峰（图1B，峰S1）。
11. 对于SDS-PAGE分析，加载5μl对应于12％聚丙烯酰胺凝胶上观察到的峰的级分。我们观察到空隙峰主要含有杂质，而峰S1包含MgtA>通过SDS-PAGE分析纯度为95％（图1B）
12. 使用vivaspin 20从峰S1中收集级分并浓缩至3 mg / ml
13. 将浓缩的MgtA分为50μl等分试样，并用液氮快速冷冻并储存在-80℃。
14. 根据我们的经验，蛋白质在这些条件下稳定超过1年。
  ＆nbsp;
  
  图1. MgtA纯化谱的代表性数据。 A. Histrap FF亲和柱的色谱图（左）。使用SDS-PAGE分析来自峰1（泳道1-4）和峰2（泳道6-11）的级分，考马斯染色凝胶（右）显示各峰的纯度。 B.尺寸排阻色谱的色谱图（左图）。使用SDS-PAGE分析来自空隙（泳道1-5）和峰S1（泳道7-14）的级分，考马斯染色凝胶（右）显示各峰的纯度。在两个SDS-PAGE凝胶图片中，MgtA在100kDa条件下运行。

数据分析

图1中色谱图的数据来自与ÄKTA净化器相关的UNICORN软件，并使用GraphPad Prism6绘图。使用Bio-Rad ChemiDoc XRS +系统扫描所有SDS-PAGE凝胶，并使用Image Lab TM 软件进行分析。

食谱

LB肉汤
在1升MQ和高压釜中混合40克LB肉汤粉末
LB卡那霉素板
混合40g LB肉汤粉末和7.5g LB琼脂和高压釜
用50μg/ ml卡那霉素制备LB板
成长媒体
40克来自Sigma-Aldrich的LB肉汤粉末（参见材料和试剂）
10克Fistex LS Ferm酵母提取物
加入1升MQ和高压釜。接种前，加入10ml 1M Tris-Hcl pH 7.4和5ml甘油
1x SDS-PAGE加载缓冲液
2％SDS
10％甘油
5％β-巯基乙醇
0.002％溴酚蓝
63mM Tris-HCl，pH6.8
缓冲区A
50mM HEPES，pH 7.0（KOH）
100mM K 2 SO 4
10％甘油
1 mM PMSF
5mMβ-巯基乙醇
1μg/ ml DNase
缓冲区B
25mM HEPES，pH 7.0（KOH）
100mM K 2 SO 4
5％甘油
1 mM PMSF
5mMβ-巯基乙醇
缓冲区C
25mM HEPE，pH 7.0（KOH）
100mM K 2 SO 4
5％甘油
1 mM PMSF
5mMβ-巯基乙醇
20mM咪唑，pH7.6。
3 CMCβ-DDM
缓冲区D
25mM HEPES，pH 7.0（KOH）
100mM K 2 SO 4
5％甘油
1 mM PMSF
5mMβ-巯基乙醇
300 mM咪唑pH 7.6
3 CMCβ-DDM
缓冲区E
25mM HEPES，pH 7.0（KOH）
100mM K 2 SO 4
5％甘油
1mM二硫苏糖醇 3 CMCβ-DDM

注意：用于色谱的缓冲液总是使用连接到真空泵的Nalgene TM 可重复使用的瓶顶过滤器进行过滤。缓冲液用相同的装置脱气，但是通过在真空继续打开并且持续搅拌的同时关闭过滤室。将缓冲液脱气至溶液中未观察到气泡

致谢

挪威研究理事会资助（F-RIMEDBIO）＃ES486454和NCMM核心资金支持这项研究。

参考

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