材料和试剂

15ml管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：339650）}
蓝色1ml移液管吸头（Greiner Bio One，目录号：686295）
黄色200μl移液管吸头（Greiner Bio One，目录号：739290）
无菌Eppendorf管（Eppendorf，目录号：0030119401）
一次性腔室滑道
DU-145前列腺癌细胞（ATCC，目录号：HTB-81）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）低葡萄糖培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D5921-500ML）
脱氧胆酸（Sigma-Aldrich，目录号：D2510-10G）
在无菌PBS（EMD Millipore，Calbiochem，目录号：400091-50MG）中的250mM二甲基草氨酸（DMOG）
去氧胆酸（Sigma-Aldrich，目录号：C9377-5G）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15250061）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F6178-500ML）
青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333-20ML）
谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513-20ML）
PBS溶液（见配方）
完成Dulbecco的媒体（见配方）
200μMDMOG（参见配方）
CDCA和DCA胆汁酸（参见配方）

设备

T25烧瓶（SARSTEDT，目录号：83.3910）
细胞刮刀（SARSTEDT，目录号：83.1831）
DM0412离心机以容纳15ml管（Scilogex，型号：DM0412）
水夹套CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：系列II）
自动吸管填充器（Gilson，目录号：F110753）
Countess自动细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：C10227）
倒置显微镜（OLYMPUS，型号：CKX31）
一次性细胞腔玻片（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：C10228）}
血细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10350141）

软件

Excel

程序

在缺氧条件下使用200μMDMOG生长DU-145前列腺癌细胞; DMOG通过在蛋白质的氧依赖性降解结构域（ODDD）处抑制HIF-1脯氨酰和天冬酰胺羟基磷酸化功能来上调正常氧HIF-1α。将种子细胞以50,000个细胞的密度接种到完全Dulbecco's培养基中的T25烧瓶中，并使其在实验前1-2天变得汇合。一旦汇合，除去培养基并用含有100μM胆汁酸+200μMDMOG，仅DMOG和仅培养基（未处理的对照）的培养基处理细胞。生成足够的烧瓶，以确保每24小时在5天期间的活力评估。
24小时后，在测定的第1天，倾析培养基，在无菌PBS中洗涤烧瓶表面以除去碎片，并使用细胞刮刀从烧瓶表面轻轻地刮擦细胞。避免胰蛋白酶-EDTA由于潜在的细胞毒性作用。向烧瓶中加入2ml无菌PBS以产生细胞悬浮液。充分混合（通过轻轻吹打上下），使细胞团匀浆。
将该2ml体积转移到15ml Falcon管中，并在160×g离心2分钟以沉淀细胞。
不要完全滗析上清液，留在管底部大约100微升。使用1 ml蓝色移液管头轻轻地将此体积与沉淀混合，得到约100-200μl的细胞悬浮液。
去除20微升，加入20微升台盼蓝到Eppendorf管和移液管混合物完全匀浆块。轻轻混合几秒钟，以染色细胞
加载两个10微升等分试样到一次性的腔幻灯片（可重复使用）的每一侧，并放入Countess自动化细胞计数器中枚举活/死细胞（生存力），表示为百分比细胞活力。

图1.二羟基化胆汁酸CDCA和DCA不影响缺氧DU-145细胞的细胞活力。对于细胞活力（台盼蓝）测定，所有细胞在缺氧条件（DMOG200μM）下生长，，除了未处理的细胞。在相对于时间的细胞活力中没有观察到显着的折衷。所有数据来自三次独立实验，每次实验至少三次重复。使用标准偏差来产生误差条。
每天重复该过程，直到收集了所有5天的数据。

百分比活力数据可以从自动细胞计数器直接读取。使用Excel（图1）将图数据作为活力（％）对时间（天）。

笔记

百分比活力数据可以从自动细胞计数器直接读取。使用Excel（图1）将图数据作为活力（％）对时间（天）。

数据分析

胰蛋白酶-EDTA不应该用于这个协议，因为它可能会诱导一些细胞死亡，可能会影响生存力，从而扭曲数据。
仅使用该方法测试DU-145前列腺癌细胞系
一次性细胞腔玻片可以使用4-5次（在水中洗涤），然而随着时间的推移，它们变得效率较低（在计数区域中产生气泡，变形计数）。
虽然该测定在缺氧条件下生长的DU-145前列腺癌细胞中进行，但是该测定可以改变，对在正常氧条件下生长的那些癌细胞有一些麻烦。实际上，对于该测定，未处理的DU-145细胞在含氧量正常的条件下生长，并产生与缺氧测试细胞（仅DMOG）的那些相似的活力，表明缺氧对生存力具有很小或没有影响。该测定可适用于在含氧量正常或缺氧条件下生长的任何贴壁细胞系，其中细胞活力是主要的测量输出。
为了证实细胞计数器数据，在测定的持续时间（5天）期间，使用血细胞计数器手动计数来自随机烧瓶的细胞。总体来说，记录93.56％±2％的平均细胞存活率，表明方法之间的相对同等性。
只要细胞是粘附的，它们可以在任何大小的板/培养皿/烧瓶上生长。然而，涉及细胞刮擦的技术问题可能出现在低表面积上
DU-145前列腺癌细胞是粘附纺锤形上皮细胞，其需要每2-3天传代。通常，细胞可以常规传代至第20代。

食谱

PBS溶液
将5个PBS片溶于1L蒸馏水和高压釜中
完成Dulbecco的媒体
10％胎牛血清 0.5％青霉素 - 链霉素 2mM谷氨酰胺
200μMDMOG
加入1.15毫升无菌PBS的干燥的粉末在瓶子
充分混合并使用最终浓度为200μM的
CDCA和DCA胆汁酸
50 mM储备液的蒸馏水溶液
使用的最终浓度：100μM

致谢

这项研究得到了欧盟委员会，爱尔兰科学基金会，爱尔兰农业和食品部，爱尔兰科学，工程和技术研究委员会以及健康研究委员会的赠款的部分支持。

参考文献

Phelan，JP，Reen，FJ，Dunphy，N.，O'Connor，R.and O'Gara，F。（2016）。胆汁酸使HIF-1α不稳定并促进癌细胞模型中的抗肿瘤表型。 BMC Cancer 16： 476。