材料和试剂

TAP培养基（Gorman和Levine，1965，
设备
1. 恒温摇摆培养箱（上海航运，型号：SPH-211B）
2. 血细胞计数器（Qiujing）
3. 冷冻容器（Cryo 1℃冷冻容器）（VWR，Nalgene ，型号：5100）
4. 高压灭菌器
5. 层流罩
6. 显微镜（OLYMPUS，型号：CX31）
7. 水浴（Amersham Bioscience）
8. 便携式液氮罐
9. 离心机（Hettich，型号：D-78532 Tuttingen）
  注意：此设备已停产，其他类型的离心力相同可用作替代。
10. -80℃冷冻器（Thermo Fisher Scientific，型号：8607）
软件
1. Microsoft Office Excel
程序
1. 细胞培养条件
  1. 使用20ml的TAP培养基在50ml烧瓶中培养细胞培养物。每周将1ml固定相细胞培养物转移到20ml新鲜培养基中。使用恒温摇动培养箱将培养条件在25℃下调节至120rpm的速度，并且用白色荧光灯（PAR =30μmol光子m <-200s -1）连续照射培养物， sup> -1 ）。以约0.9-2.0×10 7个细胞密度的细胞密度的培养物（转移后3-5天，晚期线性期）用于实验。
2. 计算C的细胞密度。和在2ml冷冻管中所需的细胞培养物体积
  1. 3-5天后转移，取1 ml细胞培养物从50ml烧瓶中进行细胞密度估算。
  2. 使用血细胞计数器测量细胞密度：将10％体积（10μl）的Lugol碘溶液与90μl细胞培养物（如果需要稀释）混合，并将8μl混合物加入每个室。
  3. 计算每个室中的五个小正方形作为计算每个室的平均细胞数的方法。每微升的细胞数=五个小方块中的平均细胞数×5×10 4稀释倍数（10/9，如果不进一步稀释）。最佳地，细胞的数量应该为约0.9-2.0×10 7个/ml细胞/ml。
    注意：步骤B2和B3可以替换为其他细胞计数方法。
  4. 计算在2ml冷冻管中所需的细胞培养物的体积，并确认冷冻管中的最终密度不超过3.3×10 6个细胞/ml（其恰好是3.3×10 6 ）。已经报道，当冷冻管中的最终细胞密度大于3.3×10 6个细胞/ml时，冷冻保存后的存活率显着降低（Piasecki等人）。，2009）。 2ml冷冻保护的细胞培养体积= 3.3×10 6个细胞/ml×1.8ml /每毫升的细胞数。用TAP培养基补充：TAP培养基体积= 0.9ml-细胞培养物体积
3. 冷冻保存过程的准备和条件
  1. 将CPA储备溶液预冷至4°C
  2. 将250 ml异丙醇放入双室冷冻容器的下部，预冷至4°C（冷却30分钟以上）。
  3. 消毒紫外线杀菌和高压灭菌器所用的所有设备和管
  4. 进行进一步培养C的所有进一步操作。（我们建议使用层流罩），以避免污染。
  5. 避免将CPA（或含有CPA的培养物）暴露于明亮的光下，因为甲醇在照射后对细胞有毒性（Crutchfield等人，1999）。
  注意：C. reinhardtii污渍CC124，CC3395，CC1690（ http://www.chlamycollection.org ）通过此协议冻存，这也很好。
4. 冷冻保存过程
  1. 冷冻保存过程基于Crutchfield的工作（Crutchfield等人，1999），具有微小的变化。我们将过程分为五个阶段，如图1所示。图1中的处理4 CC'LTR是该领域中的典型的低温保存过程。
    
    图1. C的低温处理和冷冻保存过程。。该过程分为五个阶段：（i）控制（正常生长）（C）; （ii）以1℃/min（℃）的速率从25℃冷却至-55℃; （iii）在液氮中冷冻（L）; （iv）在35℃解冻5分钟（T）;和（v）在正常生长条件（R）下恢复生长2天。生物体在每次处理中进行的过程用实线表示;对于省略的步骤，使用虚线。有6种不同的治疗组合：（1）C：仅控制（正常生长）（2）CC'T：控制，冷却和解冻; （3）CC'LT：控制，冷却，在液氮（LN）冷冻和解冻; （4）CC'LTR：控制，冷却，冻结LN，解冻和恢复生长; （5）CLT：对照，LN冻结和解冻; （6）CC'LR：控制，冷却，在LN中冷冻，在室温下孵育30分钟并恢复生长。（Yang and Li，2016）
  2. 将0.9ml CPA储备溶液（我们在我们的实验中使用两种其他CPA对照与甲醇进行比较，表1）和细胞培养物和TAP的相应体积（参见步骤B4）放入2ml冷冻管中，盖上盖子，轻轻混合。 2ml冷冻管中的总液体体积应为1.8ml，最终细胞密度为6.6×10 6个/ml细胞。
  3. 将冷冻管放入冷冻容器的上部隔室。关闭容器，将其置于-80℃的冰箱中，使其不受干扰1.5小时（图1中的"冷却"阶段）。
  4. 从冷冻容器中取出冷冻管，立即将其置于液氮中，储存1天（图1中的"冻结LN"）。
    注意：在我们的冷冻保存实践中，C. reinhardtii在存储中存活至少6个月。
  5. 从液氮中取出冷冻管，然后迅速将其转移到35℃的水浴中5分钟（图1中的"解冻"）。
  6. 在1,000×g离心冷冻小瓶2分钟。然后丢弃液体上清液，加入1ml新鲜TAP到冷冻管用于培养（防止污染）。松开冷冻瓶的盖子，每天混合其内容两次。培养条件应与对照阶段相同，但不摇动（图1中的"恢复"）
5. 存活率的计算
  为了评估细胞膜的完整性，使用伊文思蓝染料试验。冷冻保存后培养物的存活率由排除Evans蓝色染料的细胞的百分比反映。该方法遵循Crutchfield et al。（1999），但有轻微的变化
  1. 混合等体积的伊文思蓝染料（0.1％w/v的水溶液）和细胞培养物（如果需要稀释），在Eppendorf管中静置5分钟。
  2. 向血细胞计数器的每个室中加入约8μl混合物以使得能够在显微镜下计数。在室中以400×放大倍数检查至少200个细胞，独立地计数两个室以确定细胞是否摄取了伊文思蓝染料。
  3. 计算存活率如下：保留其原始绿色的细胞数量与细胞总数的比率。上述每种处理进行5次。我们的实验中每种处理的存活率（图1）显示在表1中。
  注意：在解冻后立即计数细胞时，伊文思蓝染料方法工作得很好。在进一步培养或解冻后长时间后，活细胞快速迁移，这使得它们难以计数。
表1. C的存活率。在培养基，培养基加5％DMSO和培养基加5％MeOH的冷冻干燥之后（杨和李，2016）
CM，培养基; CM + DMSO，培养基加5％DMSO; CM + MeOH，培养基加5％MeOH。值为平均值±标准偏差（n = 5）。 "*"表示其中在解冻后立即计算存活率而无需进一步培养的那些样品。

数据分析

C的存活。通过Evan的蓝色方法（参见程序E）（Crutchfield ，1999）。对于表1中的每次处理（2-6），计数5个样品。在Microsoft Office Excel中分别通过函数"AVERAGE"和"STDEV"计算平均值和标准偏差。

笔记
1. 这些实验在不同的日期（2014.7，2015.5和2015.6）重复三次，CC'LT治疗的存活率分别为55.38％，34.6％，41.3％。第二次，所用的CPA已在4℃下储存超过三个月，因此如果使用新鲜的CPA，则活力似乎上升。在光学显微镜下通过眼睛估计细胞是否用伊文蓝染色将引入一些随机误差。
2. 在恒温摇摆培养箱中需要额外的荧光照明以达到所需的照明强度
3. 确保 > 细胞培养良好：液体应该是黄绿色或绿色和均匀的，在显微镜下运行，主要包括单细胞，没有聚集体。我们使用从液体培养转移后3-5天的细胞。如果从冷冻保存培养，可能需要2次或更多次液体转移
4. 在CPA的步骤中避免光线。 CPA库存应在4°C储存不超过1个月。
5. 请小心处理液氮和-80°C冰箱，以免受伤。
食谱
1. Lugol的碘溶液
  1g I 2，2g KI，加入蒸馏水至总体积为20ml。
  使用时稀释10倍
2. CPA储存溶液
  CPA储备溶液：10％MeOH/TAP介质
  对照：在TAP培养基中仅含TAP或10％DMSO，
致谢

此协议改编自之前发表的Crutchfield 。（1999）。我们还感谢提供细胞系的Chlamydomonas资源中心的策展人Matt Laudon。这项工作是由杨和李（2016年）。作者感谢简Marczewski博士，郑国维，陈红英批评阅读协议。本研究得到国家自然科学基金（31070262），昆明植物研究所（KSCX2-EW-J-24），野生种质种质库和昆明研究院CAS创新项目（540806321211）资助，以及CAS的100人才计划。

参考文献