材料和试剂

无菌纱布（普通棉纱21s，100％脱脂棉，用于医疗用途，许多品牌都会使用，我们使用上海虹龙医疗材料公司的500g包装）
无菌250ml离心瓶（Beckman Coulter，目录号：356011）
1.5ml无菌离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
500 ml烧瓶
单面剃刀刀片（CLOUD，YIZUN BRAND，目录号：DD75）
显微镜载玻片（Grale Scientific，Sail Brand，目录号：7103）
显微镜盖玻片（CITOTEST LABWARE MANUFACTURING，目录号：80330-2810）
真菌菌株：（AmCyanPH-1）的VM3启动子下的禾谷镰孢菌株PH-1表达荧光蛋白AmCyan（Yuan等人，2008; Zhang等人， em>等，2012）。
植物材料：玉米（Zea mays ssp。mays）L.栽培品种B73植物（Schnable等人，2009）在植物营养在22-26℃，65％相对湿度和14小时光周期8周，直到第十叶出现
甘油（Sinopharm chemical Reagent，目录号：10010618）
V8蔬菜汁（Campbell Soup Company，目录号：V8 ORIGINAL）
CaCO ₃
1.5％琼脂粉
绿豆
V8汁琼脂培养基（见配方）
绿豆液体培养基（见配方）

设备

生长室（Jiangnan，型号：RXZ-1000）
孵化器（Yiheng，型号：MJ-150I）
生物安全柜（ESCO Micro，型号：FHC1200A）
不锈钢镊子（不锈钢镊子）
恒温振荡器（太仓，型号：DHZ-DA）
血球计（0.10mm，1/400mm ）（QIJUJING，型号：XB-K-25）
荧光显微镜（Olympus，型号：BX51）
共聚焦显微镜（奥林巴斯，型号：Fv10i和Fluoview FV1000）
离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-E）

软件

ImageJ软件（ http://rsbweb.nih.gov/ij/index .html ）

程序

制备F。禾本科分生孢子
注意：程序A中的操作应在已经在紫外线下消毒至少20分钟的生物安全柜中进行。
1. 吸取10微升的F的分生孢子悬浮液。禾谷镰孢在20％-30％甘油中的溶液从-80℃冰箱冷冻到V8汁琼脂平板上，并在25℃生长室中孵育3-5天。
2. 使用灭菌的镊子将现在充满气生菌丝的V8琼脂切成小块，并将这些碎片转移到100ml无菌绿豆液体培养基中，然后在25℃和150rpm的恒温摇床中温育3-5天天（图2）。
  
  图2.F的接种物的制备。禾本科。A.用 F菌丝转移培养基。禾谷镰菌转移到绿豆液体培养基中。 B.用em菌丝培养液体培养基。禾谷镰刀菌在振荡器中在25℃和150rpm下培养
3. 过滤含有F的绿豆液体培养基。禾谷镰孢分生孢子通过无菌纱布去除任何残留的琼脂，然后将过滤的液体培养基收集到无菌的250ml离心瓶中。在室温下以7,500×g离心10分钟
4. 弃去上清液，通过移液将分生孢子沉淀重悬在1ml无菌水中，然后将分生孢子悬浮液转移到1.5ml无菌离心管中。
5. 使用无菌水洗涤沉淀三次，并以7,500×g离心1分钟，直到除去所有残留的红色培养基。
6. 在约0.5ml无菌水（可以根据分生孢子的量调节水的体积）中重悬分生孢子沉淀，将20μl分生孢子悬浮液吸取到血细胞计数器上，并将分生孢子的浓度调节到10 5/sup> -10 /ml（图3A）。
  注意：在室温下储存的新鲜分生孢子悬浮液应在48小时内使用。
用玉米秆接种玉米秆。禾谷镰菌分生孢子
1. 在茎感染开花前（图3B），选择V10-V11阶段的玉米植物（具有叶缘的10个或11个完全扩展的叶）。
  注意：对于B73，通常需要大约5周才能成长到这个阶段。
2. 保持两个玉米植物作为未处理的对照，并接种其他的实验。
3. 使用无菌镊子在土壤上方的第三或第四节间处在茎中打出小孔（深度约10mm）（图3C）。将20μl分生孢子悬浮液（10 6/ml）注入孔中。
  注意：在一个实验中应接种多个玉米植物，以允许每个时间点对至少三个单独的植物进行取样用于观察和测量。应进行至少三次独立实验用于症状的统计分析。
4. 作为阴性对照，将20μl无菌水注入孔中，称为模拟接种
5. 用无菌纱布包裹接种的茎（图3D）以保持水分，并将其放置在生长室（25℃，60％湿度，10小时光/天光周期）中。
注意：整个玉米植物用于茎感染，而不是分离的茎。

图3.用F接种玉米茎的程序。禾本科。禾谷镰菌接种。 B.整个玉米植株在V10期。光盘。接种的主要步骤。红色箭头指向感染网站。黄色条=50μm，绿色条= 5cm
玉米茎感染的显微镜观察。禾本科
分生孢子。禾谷镰孢在接种后约12小时发芽（hai）：大多数菌丝在茎中72小时之前在细胞间生长，并且在感染位点周围从72小时到144小时定居在实质细胞中（Zhang等人。，2016）。
1. 在接种后的给定时间点，收获玉米植物，并且将受感染的节间纵向分裂用于目视观察（图4）。
  
  图4.症状观察的过程。黑色比例尺= 1厘米。
2. 拍摄分裂节间以记录病变发展（图5）。
  
  图5.由水（A）或em接种的节间的代表性图像。禾本科（B）。 hai：接种后数小时。绿色刻度条= 5厘米。
3. 沿着孔分割感染的玉米秆，将分裂节间的一半纵向或横向切成长度和宽度为5-10mm的小切片，并将其放置在浸没在由盖玻片覆盖的无菌水中的载玻片上。
4. 显微镜观察设置
  使用BX51（Olympus）拍摄，然后使用具有450-480nm的激发波长和515nm的发射波长的滤光器的荧光图像。将三个基本颜色比率设置为红色：蓝色：绿色= 1.5：1：1。将明场和荧光图像合并（图6）。
  
  图6.化合物显微镜观察。禾谷镰孢菌丝生长在玉米茎秆组织中。 H：禾谷镰菌AmCyan PH-1菌丝，显示绿色荧光。海：接种后数小时。比例尺=100μm。
5. 共焦显微镜观察
  选择两个通道：具有405nm激发波长的通道1和460-500nm发射波长是用于F的AmCyan荧光。禾谷镰菌菌丝，具有405nm激发波长和570-670nm发射波长的通道2用于细胞壁自体荧光。最终图像由两个通道合并。
  注意：由于玉米茎组织也显示自发荧光，真菌荧光的识别需要理解背景玉米信号，如图1所示。例如，见图7.
  
  图7.在指定时间点感染的节间的代表性纵断面图像。 V：维管束; P：实质细胞;海：接种后数小时。注意来自植物细胞壁的自体荧光信号比未感染的茎更强。比例尺=100μm。

数据分析

在指定时间使用ImageJ软件（ http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html ）。测量棕色区域的顶部和底部正面的从伤口线的平均距离作为半损伤尺寸（如图8所示）。使用具有GFP滤光片的荧光显微镜测量菌丝前进距离（图8）

图8.损伤尺寸，半损伤尺寸和菌丝前进距离的测量

笔记

该协议使用水平创伤，而不是45°C的创伤角度。水平协议提供更均匀的真菌生长。

食谱

V8汁琼脂培养基
168毫升V8蔬菜汁
1克CaCO 3
用无菌双蒸水
加入1 L 将其分成小份，加入15克琼脂粉
在121℃高压灭菌20分钟
绿豆液体培养基
40克绿豆（ Vigna radiata ）（干燥，可在杂货店或超市如家乐福，图9）
1升无菌双蒸水
煮沸约10分钟，让其冷却至室温（通常需要2小时）通过纱布过滤并丢弃豆渣
在121°C高压灭菌20分钟，使用前在室温下保存

图9.用于制备中等的绿豆

致谢

该方案从以前的禾本科植物Colletotrichum graminicola的接种方法改进（Tang等人，2006）。我们感谢Sheila McCormick博士编辑协议。唐实验室的研究由中国科学技术部（授予2016YFD0100600），中国自然科学基金（拨款31570318）和中国农业部（拨款2016ZX08009-003）支持。

参考文献

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