材料和试剂

（24 x 40 mm）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：125485J）（在5％二氯二甲基硅烷在1,1,1-三氯乙烷中边缘硅化，见注3）
玻璃毛细管由50μl抽吸管（Drummond Scientific，目录号：2-000-050）制成（图1A和1B，视频1;见注4）
手动注射器（ST科学，UJB型）
直径3.5厘米的未经处理的塑料盘（岩壁，目录号：1000-035）
剃刀刀片
Millicell-CM插入件，直径为12mm（EMD Millipore，目录号：PICM01250）
玻璃针（2毫米直径）与细小的尖端
水稻植株（日本晴天）（见注1）
饲养细胞：水稻悬浮细胞培养物（Line Oc，由RIKEN Bio-Resource Center，Tsukuba，Japan提供）（参见注2）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M8410-100ML）
甘露醇（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：133-00845）
绝对乙醇（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：057-00451）
370 mosmol/kg H 2 O（330mM）甘露醇溶液（高压灭菌）
450 mosmol/kg H 2 O（385mM）甘露醇溶液（高压灭菌）
520 mosmol/kg H 2 O（430mM）甘露醇溶液（高压灭菌）
CHU（N6）基础盐混合物（Sigma-Aldrich，目录号：C1416）
Na 2 O 2 O 2 O 2（和光纯药工业公司，目录号：514-30001）
CoCl 2·6H 2 O（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：036-03682）
CuSO 4·5H 2 O（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：039-19385）
视黄醇（Sigma-Aldrich，目录号：R7632）
Calciferol（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：039-00291）
生物素（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：023-08711）
Thiamin·HCl（Nacalai Tesque，目录号：36319-82）
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：N4126）
吡哆醇·HCl（和光纯药工业公司，目录号：163-05402）
氯化胆碱（Sigma-Aldrich，目录号：C7527）
泛酸钙（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：031-14161）
核黄素（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：180-00171）
2,4-D（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：040-18532）
钴胺（Sigma-Aldrich，目录号：V2876）
对氨基苯甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：100536）
叶酸（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：062-01801）
抗坏血酸（和光纯药工业公司，目录号：012-04802）
苹果酸（Sigma-Aldrich，目录号：M1000）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：251275）
富马酸（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：069-00652）
丙酮酸钠（Tokyo Chemical Industry，目录号：P0582）
谷氨酰胺（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：078-00525）
酪蛋白水解物（BD，目录号：22 3050）
肌醇（和光纯药工业公司，目录号：094-00281）
葡萄糖（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：049-31165）
MS盐（和光纯药工业公司，目录号：392-00591）
MS维生素（Sigma-Aldrich，目录号：M7150）
蔗糖（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：196-00015）
山梨醇（和光纯药工业公司，目录号：198-03755）
1-萘乙酸（Nacalai Tesque，目录号：23628-32）
激动素（Sigma-Aldrich，目录号：K3378）
Gelrite（Wako Pure Chemicals Industries，目录号：075-05655）
二氯二甲基硅烷（Tokyo Chemical Industry，目录号：D0358）
1,1,1-三氯乙烷（Tokyo Chemical Industry，目录号：T0380）
合子培养基（见食谱）
再生媒体（见食谱）
生根媒体（见食谱）

设备

立体显微镜（OLYMPUS，型号：SZ61）
倒置显微镜（OLYMPUS，型号：IX-71或IX-73）
镊子
电融器（Nepa Gene，型号：ECFG21）
机械手（NARISHIGE，型号：M-152），带双吸液管支架（NARISHIGE，型号：HD-21）
电极（Nepa Gene，型号：CUY5100Ti100）固定在移液器支架上
用于插入盖玻片和塑料盘的滑动台
环保厅
电荷耦合器件相机（Pixcera，型号：企鹅600CL）

软件

InStudio软件（Pixcera）

程序

配子的分离
1. 用0.3ml矿物油覆盖硅化盖玻片，并使用玻璃毛细管连接在盖玻片上的矿物油内部制备数个1-2μl甘露醇液滴（370 mosmol/kg H 2 O 2）（图1C）到处理注射器。请注意，液滴无法接近空气（图1D）。
  
  图1.盖玻片上的玻璃毛细管（A，B）和甘露醇液滴（C，D）。 A.用手绘的玻璃毛细管。 B.面板A中的玻璃毛细管的尖端开口。C和D.矿物油中的甘露醇液滴的照片（C）和图像（D））在硅化盖玻片上。酒吧= A，C为1厘米，B为200厘米
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  视频1.制作玻璃毛细管
  
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2. 收集一些鲜花已经开放的圆锥花序，其他花朵仍未开花。从圆锥花序中取出未花粉的，并在立体显微镜下剖析。隔离卵巢，并将其转移到装有3ml甘露醇溶液（370 mosmol/kg H 2 O）的3.5cm塑料盘中（图2A）。
3. 对于卵细胞分离，从卵巢中取出柱头并将其转移到装有3ml甘露醇溶液的新的3.5cm塑料盘中（参见附注5）。允许卵巢下沉到碗的底部，并用中间的剃刀刀片横向切割（图2A和2B）。在倒置显微镜下，确定从切割卵巢下部释放的卵细胞（图2C;见附注6）。通过使用连接到处理注射器的玻璃毛细管，收集卵细胞并将其转移到步骤A1中制备的甘露醇液滴中（图4A;参见附注7）。
  
  图2.从卵巢中分离卵卵细胞 A.开花前从米花中收获的卵巢。红线表示卵隔离的切割线。 B.在甘露醇溶液中切割卵巢。 C.从解剖卵巢的基底部分释放的稻蛋细胞（箭头）。
4. 对于精子细胞分离，在立体显微镜下切开未开封的花，以获得花药，并将花药转移到装有3ml甘露醇溶液（370mosmol/kg H 2 O 2）的3.5cm塑料盘中。用镊子打破甘露醇溶液中的花药以释放花粉颗粒（图3A）。由于渗透冲击和释放精子细胞，花粉粒爆裂。在倒置显微镜下鉴定精子细胞（图3B）。通过使用连接到处理注射器的玻璃毛细管，收集精子细胞并转移到步骤A1中制备的甘露醇液滴中。（图4B;见注8）
  
  图3.从花粉粒中分离水稻精子细胞A.在甘露醇溶液中破碎的花药（箭头）和释放的花粉粒（箭头）。 B.花粉粒（箭头）释放其甘露醇溶液中的含量。两个精子细胞用正方形封闭。棒=500μm，A为20μm，B为20μm
孤立配子的融合
1. 设置融合装置并调整电极的位置（图4C和5）
2. 将一个卵细胞转移到六个甘露醇液滴中的每一个（图4C），然后将1或2个精子细胞转移到每个液滴中。
3. 使用操纵器（视频2和3）将电极的位置降低到融合液滴中，并且在交流（AC）场（1MHz，5V rms）下在一个电极处对准和固定两个配子。在AC场下，配子向电极移动。通过移动与机械手连接的电极，首先将鸡蛋固定在电极上。使用相同的程序，将精子细胞固定在雌配子上（图4D）。将电极的最终距离调整到单元直径之和的大约两倍。
4. 使用薄玻璃毛细管将0.5-1.0μl甘露醇溶液（520 mosmol/kg H 2 O）轻轻加入熔融液滴（图4E，见附注9）。
5. 通过施加单负负直流（DC）脉冲（50微秒，12-15伏）诱导细胞融合（图4F和4G，视频4，参见附注10）。
6. 通过轻轻移动电极，从电极中取出融合产品。使用机械手将电极移出液滴，并在步骤B3进行下一个配子融合（见注11和12）。
  
  图4.分离的稻配子（A和B）和配子的电融合（C-G）。A.分离的稻卵细胞。 B.从花粉粒释放的水稻精子细胞。 C.用覆盖有矿物油的盖玻片上的融合液滴的说明。灰色条和薄三角形表示电极。 D.在融合液滴中的交流（AC）场下，在电极之一上将卵细胞与精子细胞（箭头）对准。 E.加入甘露醇溶液后，对准卵和精子细胞，渗透压高于融合液滴。精子细胞变成长圆形（箭头）。 F.在直流（DC）脉冲之后，配子融合。箭头表示融合点。 G.融合后10秒的合子。箭头表示融合点。棒在A，D中为50μm，在B中为5μm。
  
  图5.由倒置显微镜，电融合装置，机械手和电极组成的融合系统
  
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  视频2.将电极调整为转移了卵细胞和精子细胞的甘露醇液滴
  
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  视频3.甘露醇液滴中的电极
  
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合作伙伴的文化与发展
1. 将0.2ml受精卵培养基置于Millicell-CM插入物中，并放入含有2ml培养基的3.5cm塑料皿中。将40-60μl的悬浮细胞培养物加入到作为饲养细胞的培养皿中
2. 通过用无水乙醇和无菌水洗涤将微毛细管灭菌后，将IVF生产的合适转移到新鲜的甘露醇液滴（450 mosmol/kg H 2 O 2）中，然后转移到Millicell的膜上-CM插入（图5A）。
  
  图6.合子的文化与发展。 A.合子文化的例证; Millicell插入中的一个白色圆圈表示一个合子。浅蓝色长圆形代表饲养细胞的聚集体。 B.融合后1 h的合子; C.融合后4 h的合子;两个核仁由箭头指示。 D.融合18小时后的不对称双细胞胚胎; E和F.融合后48 h胚胎核染色，分别通过明场和荧光显微镜观察; G.融合后5天的细胞团，其从球状样胚发育; H.融合18天后的白细胞集落; I.将白细胞集落（图H）转移到再生培养基（融合后22天）4天后开发的细胞集落。绿色斑点在细胞集落中/上可见。再生枝条在白细胞集落传代培养8天后（融合后26天）可以观察到芽的产生。 K.在无激素培养基（融合后43天）中再生培养12天后的一个小植株; L.具有种子组的再生植物（融合后100天）。酒吧= B-E和G为50μm，H-J为1毫米，K为1厘米。
3. 在26°C的黑暗条件下接受合子过夜培养而不摇动后，继续用轻轻摇动（40 rpm）进行培养（图6B-6F;见注释13和14）。
4. 融合后5天，通过将含有胚胎的Millicell培养皿转移到装有2ml新鲜的合子培养基的新的35mm直径的培养皿中（图6G;参见附注15），去除饲养细胞。继续上述培养。
5. 培养18天后，通过使用灭菌的巴斯德吸管（注16），将在Millicell-CM中的IVF产生的合子开发的传代培养细胞集落插入塑料盘中的再生培养基。在连续光照30℃下孵育12-30天（图6H;见附注17）
6. 将分化的芽转移到塑料盘中的生根培养基中，并在28℃的13/11小时/黑暗循环下培养它们11-13天（图6I和6J）。
7. 将所得的小植株转移到土壤荚（直径20-28厘米，深度30-35厘米），并在环境室中生长，如注1（图6K）所述。如果需要，从再生植物收获种子并发芽（图6L）

数据分析

使用冷却的电荷耦合器件相机（Penguin 600CL; Pixcera，Los Gatos，CA，USA）和InStudio软件（Pixcera）获得配子，合子及其产生的胚胎的数字图像。

笔记

水稻植物在13/11小时的光/暗循环中在26℃的环境室中生长，光合子光子通量密度为150-300μmol光子，其中p <！ - SIPO 。在这些生长条件下，可以在整个季节获得花
根据RIKEN生物资源中心的指示，每周将水稻悬浮液细胞系Oc进行传代培养。新近传代培养的细胞与一周培养细胞之间的饲喂效应没有差异
盖片应该是非涂层的，因为使用涂覆的盖玻片将导致细胞附着到盖玻片的表面。
用手将尖端开口拉伸至150-250μm
不排除柱头，卵巢总是漂浮在甘露醇溶液上。为了分离卵细胞，将卵巢沉入甘露醇溶液是至关重要的。通常，将15-25个卵巢放入盘中。
通常，3-8个卵细胞从大约20个切割的卵巢中自动释放。用玻璃针轻轻按下切割卵巢下部的基部，会产生额外的卵细胞。
卵细胞可以保持在甘露醇液滴中，直到分离6小时才能进行IVF，而不会降低融合效率。或者，卵细胞可以在4℃下储存过夜，以备第二天使用。
分离后1 h内精子细胞应用于体外受精。否则，精子细胞似乎退化，不能与卵细胞融合
添加具有较高渗透压的甘露醇溶液将精子细胞的形状改变为长圆形，并使卵细胞与电极的连接更稳定（图4D和4E）。没有这种处理，通过DC脉冲诱导的融合，卵细胞通常从电极释放，并且融合效率大大降低
如果没有发生细胞融合，则减小两个电极之间的距离并再次脉冲。
在每轮融合程序中，推荐使用5-6组配子融合（图4C），因为进行多组配子融合需要时间，精子细胞在实验过程中会退化。
在最佳条件下，成功电融合的效率约为85％。可以从一百个加工的卵巢中分离20至40个卵细胞，一天一个实验者可以将15-30个卵细胞与精子细胞融合。
由IVF产生的稻米合子开始形成细胞壁（图6B），融合后至少4小时可以在受精卵中观察到两个核仁（图6C）。在融合后约12小时，合子中可见的发育良好的颗粒细胞器（可能是淀粉颗粒）可见，并且融合后17-22小时观察到受精卵的第一不对称细胞分裂（图6D）。第一次分裂后，双细胞胚胎在融合后40-50小时继续发育成早期胚胎（图6E和6F）。
约90％的IVF产生的合子分为双细胞胚胎，90％的IVF产生的双细胞胚胎发育成球状胚胎。
培养IVF生产的受精卵五天后，不需要与饲养细胞共同培养
细胞集落直径约为1-2毫米，可用巴斯德吸管转移。
通常，在固化再生培养基（融合后22天）传代细胞集落四天后，绿斑变得可见，并且在传代培养8天（融合后26天）时观察到多个芽的出现。大多数传代培养的细胞集落形成绿色斑点和多个芽。

食谱

合子培养基（N6Z-培养基[Kumlehn等人，1998]，修改）
2g/L CHU（N6）基础盐混合物
0.025mg/L Na 2 MoO 4·2H 2 O 0.025mg/L CoCl 2·6H 2 O
0.025mg/L CuSO 4·5H 2 O
0.01 mg/L视黄醇
0.01mg/L calciferol
0.01 mg/L生物素
1mg/L硫胺素·HCl
1mg/L烟酸
1mg/L吡哆醇·HCl
1 mg/L氯化胆碱
1 mg/L Ca-pantothene
0.2 mg/L核黄素
0.2 mg/L 2,4-D
0.02 mg/L钴胺
0.02mg/L对氨基苯甲酸
0.4 mg/L叶酸
2mg/L抗坏血酸
40毫克/升苹果酸
40 mg/L柠檬酸
40毫克/升富马酸
20毫克/升的丙酮酸钠 1000 mg/L谷氨酰胺
250 mg/L酪蛋白水解产物
100毫克/升肌醇蛋白
重量份浓度，450 mosmol kg ^-1 H 2 O调整葡萄糖
调整至pH 5.7并过滤消毒的
再生培养基（具有一些修饰的固化MS培养基[Hiei等人，1994]）
MS盐
MS维生素
100毫克/升肌醇蛋白
2克/升酪蛋白氨基酸
30克/升蔗糖
30 g/L山梨醇
0.2mg/L 1-萘乙酸（NAA）
1 mg/L激动素
0.3％gelrite
生根媒体
与再生培养基相同，但省略了山梨醇，激动素和NAA

致谢

该协议由Uchiumi等人改编。（2007）和冈本（2010）。这项工作得到了日本的教育，文化，体育，科技部（TO-26113715 TO TO）和日本的科学促进会（赠款援助号）的部分支持。 16K14742到TO）。感谢Tomoko Mochizuki女士（东京都大学）提供技术援助。

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