材料和试剂

圆锥管：
15 ml（Greiner Bio One，目录号：188261）
50ml（Greiner Bio One，目录号：227261）
1.5ml离心管（Greiner Bio One，目录号：616201）
0.2ml平头PCR管（Corning，Axygen，目录号：PCR-02-C）
培养皿（Greiner Bio One，目录号：633185）
BD Plastipak 10 ml注射器（BD，目录号：302188）
Millex-GP 33mm直径的无菌注射器过滤器单元（聚醚砜[PES]膜，孔径：0.22μm）（EMD Millipore，目录号：SLGPO33RS）
适当的粟酒裂殖酵母菌株：为了标记交换，菌株必须已经携带用 ura4 ⁺或标记的突变体或标记基因MX 类型标记，例如 kanMX ， natMX 或 hphMX （Bähler等人）。，1998; Goldstein和McCusker，1999）。当将 arg3MX4 ，他的3XX4 ， leu1MX4 或 ura4MX4 引入应变时，需要为（Waddell和Jenkins，1995），他们的原始基因座（例如，，arg3-D4 ，his3-D1 （Burke and Gould，（Keeney和Boeke，1994），或者ura4-D18（Grimm等人，1988）。
质粒：pALo120（FYP2884），pALo121（FYP2885），pALo122（FYP2886），pFA6a-arg3MX4（FYP2890），pFA6a- his3MX4（FYP2891），pFA6a- leu1MX4（FYP2892）和pFA6a- ura4MX4（FY2893）（Lorenz，2015a和2015b）;质粒可以从日本MEXT的国家生物资源项目（NRBP）获得（订购时请参考FYP号码）。
超声鲑鱼精子DNA（Sigma-Aldrich，目录号：31149）
琼脂糖，分子级（Bioline，目录号：BIO-41026）
Q5高保真DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0491）
5x Q5反应缓冲液（Q5高保真聚合酶的附件）（New England Biolabs，目录号：M0491）
10mM dNTP（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：R0191）}
10μM寡核苷酸（用作PCR反应中的引物）（Sigma-Aldrich，USA）
来自MilliQ Advantage A10系统（EMD Millipore，目录号：Z00Q0V0WW）的MilliQ H 2 O 2
CutSmart缓冲液（限制酶的附加部分，也可以在New England Biolabs下分别订购，目录号：B2704）
限制酶：
Xba I限制酶（New England Biolabs，目录号：R0145）
HI-HF限制酶（New England Biolabs，目录号：R3136）
RI-HF限制酶（New England Biolabs，目录号：R3101）
II-HF限制酶（New England Biolabs，目录号：R3151）
I-HF限制酶（New England Biolabs，目录号：R3156）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10526383）
氢氧化钠（NaOH）颗粒（无水）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
三羟甲基氨基甲烷（VWR，目录号：103156X）
冰醋酸（100％）乙酸（VWR，目录号：20104.334）
酵母提取物，微粒化（ForMedium ^TM，目录号：YEM02）
无水葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10373242）
腺嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：A5665）
尿嘧啶（ForMedium ^TM，目录号：DOCO212）
亮氨酸（ForMedium ^TM，目录号：DOCO156）
赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L8662）
组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：H5659）
精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6969）
琼脂颗粒（ForMedium ^TM，目录号：AGR10）
G418二硫酸盐（ForMedium ^{，商品号：G4181）}
硝酸二氢硫酸（clonNAT）（Werner BioAgents，目录号：clonNAT）
潮霉素B（ForMedium ^{TM，目录号：HYG1000）}
无氨基酸和无硫酸铵的酵母氮碱（ForMedium ^{TM，目录号：CYN0502）}
L-谷氨酸单钠盐水合物（谷氨酸钠）（Sigma-Aldrich，目录号：G5889）
5N盐酸（HCl）（VWR，目录号：30018.320）
乙酸锂（Sigma-Aldrich，目录号：L4158）
聚乙二醇（PEG）MW 3,350（Sigma-Aldrich，目录号：P4338）
DNA分子量标记，HyperLadder ^{1 kb（Bioline，目录号：BIO-33025）}
0.5 M EDTA（pH 8.0）（参见食谱）
50x TAE凝胶电泳缓冲液（见配方）
YES（酵母提取物补充）肉汤（见食谱）
YES板（见配方）
在YES媒体中浓缩抗生素（见食谱）
YNG（酵母氮谷氨酸）板（见食谱）
1M Tris / HCl（pH 7.5）（参见食谱）
1 M LiAc（pH 7.5）（见配方）
10x TE（pH 7.5）（参见食谱）
LiAc / TE（参见食谱）
40％PEG（参见食谱）

设备

用于培养酵母的Erlenmeyer玻璃烧瓶（DURAN Group，目录号：2177144）
Infor HT多频标准振荡培养箱（Infors，型号：Multitron Standard）
静电培养箱（Gallenkamp强制空气培养箱）（Weiss Technik UK）
水浴（Grant Instruments，目录号：JBN5）
Eppendorf微量离心机（Eppendorf，型号：5424R）
MJ Research PTC-100可编程热循环仪
由具有7×10cm托盘的凝胶电泳室（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-Sub Cell Cell）组成的核酸凝胶电泳系统和电源（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac ^{^TM}基本电源）
NanoDrop 2000c UV / Vis-spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{，型号：ND-2000C）}
Sigma 4-16K离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：Sigma 4-16K）
血细胞计数器，Neubauer型改进（Marienfeld-Superior，目录号：0630010）
Leica DM500显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DM500）
Classic Media 12升高压灭菌器（Prestige Medical，型号：210048）

程序

生成用于转换的标记交换盒
用于以下乙酸锂方案的标记交换盒可以通过两种替代方法产生;通过以前在Lorenz（2015a和2015b）中描述的质粒的限制性内切核酸酶消化或通过PCR扩增（见下文）进行PCR扩增。使用适当的修改，该协议也可以应用于其他地方描述的构造（Sato et al。，2005; Hentges等人，2005; Gadaleta等人， em，2013; Chen等人，2015）。在PCR或限制性消化后，在80V的1×TAE的0.8％琼脂糖凝胶上进行1/20体积的每个反应45分钟以验证反应是否正常工作（每个反应的预期带尺寸详述如下）。通过加入2μl0.5M EDTA（pH8.0）来终止PCR反应或限制性的其余部分。在NanoDrop 2000c UV / Vis分光光度计上测量DNA浓度，每次转化使用适当的体积（最大20μl）以产生1-5μg盒式DNA。
1. ura4 ⁺标记交换盒放大
  1. 50μlPCR反应包含：
    来自质粒pALo120，pALo121或pALo122（Lorenz，2015a和2015b）的100ng DNA通过PCR产生用于将 ura4 ⁺标记置换到kanMX6的盒， natMX4 或 hphMX4 标记。
    10μl5x Q5反应缓冲液
    200μMdNTPs
    作为引物的AL1forw（5'-agctacaaatcccactgg-3'）和AL1rev（5'-gtgatattgacgaaactttttg-3'）寡核苷酸各500nM， 1 U Q5高保真DNA聚合酶
    通过加入适量的无菌MilliQ水补足50μl（见注1）
  2. 使用以下PCR程序：
    98°C 30秒
    35×（98℃10秒，55℃20秒，72℃85秒）
    72°C 120秒，
  3. 转换盒的期望带尺寸：
    pALo120（ ura4 ⁺ -to- kanMX6 交换盒）：1.97 kb
    pALo121（ ura4 ⁺ -to- natMX4 交换磁带）：1.74 kb
    pALo122（ ura4 ⁺ -to- hphMX4 交换盒）：2.2kb
2. 限制性消化释放 ura4 ⁺标记交换磁带
  1. 20μl反应物含有：
    12μg来自质粒pALo120，pALo121或pALo122的DNA（这将导致约5μg的标记交换盒DNA）（Lorenz，2015a和2015b）。
    2μlCutSmart缓冲液
    2μlXba I限制酶
    加入适量的无菌MilliQ水补足20μl（见注1）
  2. 在37℃下孵育反应1小时
  3. 限制性消化后预期的胶带尺寸：
    pALo120：1.98kb（盒）和2.64kb（载体骨架）
    pALo121：1.75kb（盒）和2.64kb（载体骨架）
    pALo122：2.2kb（盒）和2.64kb（载体骨架）
3. MX 标记交换磁带放大器
  1. 50μlPCR反应包含：
    来自质粒pFA6a-arg3MX4的100ng DNA，pFA6a- his3MX4，pFA6a- leu1MX4或pFA6a-ura4MX4 （Lorenz，2015a和2015b）通过PCR创建盒子，将任何MX型标记交换到arg3 ⁺， his3 ⁺， leu1 ⁺或 ura4 ⁺标记。
    10μl5x Q5反应缓冲液
    200μMdNTPs
    作为引物的AL2forw（5'-gtttagcttgcctcgtccc-3'）和AL2rev（5'-gatggcggcgttagtatcg-3'）寡核苷酸各500nM 1 U Q5高保真DNA聚合酶
    通过加入适量的无菌MilliQ水补足50μl（见注1）
  2. 使用以下PCR程序：
    98°C 30秒
    35×（98℃10秒，64℃20秒，72℃90秒）
    72°C 120秒，
  3. 转换盒的期望带尺寸：
    pFA6a-> arg3MX4 ：2.54 kb
    pFA6a-他的3MX4 ：2.65kb
    pFA6a- leu1MX4 ：2.19 kb
    pFA6a- ura4MX4 ：2.39kb
4. 限制性摘要解放arg3MX4 ， leu1MX4 和 ura4MX4 标记交换磁带
  1. 20μl反应物含有：
    来自质粒pFA6a-arg3MX4，pFA6a- leu1MX4或pFA6a- ura4MX4的10μgDNA（这将导致〜5μg的标记交换盒式DNA）（Lorenz，2015a和2015b）。
    2μlCutSmart缓冲液
    1μlBamHI HI-HF限制酶
    1μlEco-RI-HF限制酶
    加入适量的无菌MilliQ水补足20μl（见注1）
  2. 在37℃下孵育反应1小时
  3. 限制性消化后预期的胶带尺寸：
    pFA6a-> arg3MX4 ：2.6kb（盒式）和2.47kb（载体骨架）
    pFA6a- leu1MX4：2.24kb（盒式）和2.47kb（载体骨架）
    pFA6a- ura4MX4：2.44kb（盒）和2.47kb（载体骨架）
5. 限制性消化以释放他/她的3XX4标志交换盒
  1. 20μl反应物含有：
    来自质粒pFA6a- his3MX4的10μgDNA（这将导致约5μg的标记交换盒DNA）（Lorenz，2015a和2015b）。
    2μlCutSmart缓冲液
    1μlPvu II-HF限制酶
    1μlSac I / HF限制酶
    加入适量的无菌MilliQ水补足20μl（见注1）
  2. 在37℃下孵育反应1小时
  3. 限制性消化后预期的胶带尺寸：
    pFA6a- his3MX4 ：2.72kb（盒式）和2.44kb（载体骨架）
乙酸锂转化
1. 在振荡培养箱中在30℃下将来自待转化菌株的100ml酵母细胞培养至约1×10 7个细胞/ ml的密度（用血细胞计数器计数至建立密度）（见注2和3）。
2. 通过在20℃下以1,900×g离心（在两个50ml锥形管中）收获3分钟。
3. 将细胞重悬于25毫升无菌MilliQ水中，并结合成一个50ml锥形管
4. 在20℃下以1,900×g离心收获3分钟。
5. 将细胞重悬在5ml LiAc / TE（参见食谱）中，在20℃下以1,900×g离心3分钟。
6. 将细胞重悬于1ml LiAc / TE中并转移到1.5ml离心管中
7. 在室温下以2,300×g离心1分钟。弃去上清并在LiAc / TE中以〜3×10 9个细胞/ ml重悬细胞（通常300μl，如果起始培养物为100ml 1×10 7个细胞/ ml）
8. 向100μl细胞中加入2μl超声处理的鲑鱼精DNA（10毫克/毫升）和DNA转化（1-5微克，最大体积为20微升）。通过仔细地上下移动来混合。
9. 在室温下孵育10分钟
10. 加入260μl40％PEG（参见食谱和注释4），并在30℃下孵育2-6小时。通过仔细地上下移动来混合。
11. 加入43μlDMSO（二甲基亚砜），将管倒置5次，并在42℃下热休克5分钟（参见附注5）。
12. 将板悬浮液均匀分布在3个YES板上（每个板上约135μl），无需选择（参见食谱）。
13. 在30℃孵育24-48小时后，将这些板复制到选择性板上;要么是含有相应抗生素的YES，要么对YNG缺乏相应的补充。
14. 允许选择性板在30℃下生长数天，直到单个菌落达到3-4mm的直径。
15. 将至少20个菌落补充到新鲜的选择性板上并孵育24-48小时。
16. 将复制板置于新鲜的选择性板上并选择原始标记的板上，以确保标记交换正确（例如，如果原始菌株为 ura4 ⁺和pALo120用于交换到kanMX6，所得菌株必须耐G418抗性，并且在缺乏尿嘧啶的培养基上无法生长。

数据分析

单步标记交换程序的关键步骤是确认标记已经在转化体（即）中真正交换，新的标记正确集成在目标位点，从而去除原始标记已知在其预期目标位点处的标记整合在粟酒裂殖酵母中不是完全有效的，并且已经报道了广泛的正确的积分频率（Bähler等人， 1998; Sato等人，2005）。正确的整合受几个参数的影响，包括基因组位点的染色质状态和标记盒侧翼序列同源性的长度。在所提出的单步标记交换盒中，侧翼序列同源性在200和400bps之间，其长于所需的最小80bps（Bähler等人，1998），但不足以使得在所有情况下100％正确的定位。将 ura4 ⁺标记交换到任何抗生素MX 标记以22.9-100％之间的频率发生。在减数分裂基因hop1上测试将MX标记物交换到营养标记物的正确的整合效率;由于减数分裂开放阅读框处的闭合染色质状态，这是更具挑战性的（Bähler等人，1998）。因此，与营养标记物交换kanMX6 -marker删除hop1 的频率较低，在15.3-36.6％之间变化（Lorenz，2015a）。

笔记

当移取PCR反应或限制性消化时，始终从MilliQ水开始，加入缓冲液，然后加入所有其他组分，最后加入酶。从这些协议工作，重要的是在设置反应之前计算所需的水量。
对于转化方案，使用预先不超过7天条纹到合适平板的酵母细胞。在使用之前，请仔细检查酵母菌株的基因型！
将裂殖酵母细胞生长至晚期对数期（〜1×10 7个细胞/ ml）是至关重要的，以实现最有效的转化频率。由于细胞进入固定相并形成较厚的细胞壁（，不生长细胞至高于1×10 ^{），细胞生长至较高密度将导致转化体数量急剧减少。 7细胞/ ml，稀释）。}
在进行转化的当天，需要新鲜地制备40％PEG（参见食谱）。
持续时间和温度的热休克（步骤B11）至关重要！

食谱

0.5M EDTA（pH8.0）（1L）
186.1g乙二胺四乙酸（EDTA）
加入800毫升MilliQ水
通过加入NaOH颗粒调节pH至8.0（当pH> 7时溶液将变得清晰）
弥补MilliQ水量
高压消毒灭菌
50倍TAE凝胶电泳缓冲液（1升）
242g Tris（羟甲基）氨基甲烷
57.1毫升冰醋酸
100ml 0.5M EDTA（pH8.0）
弥补MilliQ水量
高压消毒灭菌
在MilliQ水中稀释1:50，作为1x TAE使用
YES（酵母提取物补充）肉汤（1L）
5克酵母提取物，微粒化的
30克无水葡萄糖 250毫克腺嘌呤
250毫克尿嘧啶
250毫克亮氨酸
250毫克赖氨酸
250毫克组氨酸
250毫克精氨酸
弥补MilliQ水量
高压消毒灭菌
YES板（1升，约40块板）
作为YES肉汤
20克琼脂造粒
高压消毒灭菌
YES媒体中浓度的抗生素（每1升）
注意：高压灭菌后，将抗生素加入到冷却至55℃的YES琼脂中。
200mg G418二硫酸盐
200毫克海洛替清 - 硫酸二氢盐（clonNAT）
400毫克潮霉素B
YNG（酵母氮谷氨酸）板（1L，制成约40个板）
1.9克酵母氮碱（不含氨基酸，不含硫酸铵）
3.7克L-谷氨酸单钠盐水合物（谷氨酸钠）
30克无水葡萄糖 20克琼脂造粒
75毫克腺嘌呤
75毫克尿嘧啶
75毫克亮氨酸
75毫克赖氨酸
75毫克组氨酸
75毫克精氨酸
弥补MilliQ水量
高压消毒灭菌
1M Tris / HCl（pH7.5）（1L）
121.1g三（羟甲基）氨基甲烷
加入800毫升MilliQ水
通过加入5N HCl将pH调节至7.5 弥补MilliQ水量
高压消毒灭菌
1M LiAc（pH7.5; 100ml）
20.4克醋酸锂
加入70毫升MilliQ水
如果需要，用乙酸调节pH至7.5 弥补MilliQ水量
高压消毒灭菌
10x TE（pH 7.5; 100ml）
2ml 0.5M EDTA（pH8.0）（终浓度0.01M） 10ml 1M Tris / HCl（pH7.5）（终浓度0.1M）
弥补MilliQ水量
通过高压灭菌消毒
LiAc / TE（10ml）
1 ml 1M LiAc（pH 7.5）
1 ml 10x TE（pH 7.5）（0.1M Tris，0.01M EDTA） 8毫升无菌MilliQ水
40％PEG（10ml）
4g PEG（聚乙二醇）MW 3,350
1 ml 1M LiAc（pH 7.5）
1ml 10x TE（0.1M Tris，0.01M EDTA） 4毫升无菌MilliQ水
完全溶解PEG（如有必要，在37℃下孵育数分钟）。
补充10 ml
过滤灭菌

致谢

我们承认英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC，博士培训授权BB / FO16964 / 1）和英国阿伯丁大学生命科学与医学学院的资助。

参考文献

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