材料和试剂

一次性手术刀（Swan Morton，目录号：0510）
带凸轮的培养皿92 x 16毫米（SARSTEDT，目录号：82.1473）
微量离心管，1.5毫升（VWR，目录号：212-0198）
管10 ml，100 x 16 mm，PP（SARSTEDT，目录号：62.9924.284）
管50毫升，30×115毫米，PP（康宁，猎鹰，目录号：352070）
70μm尼龙过滤器（Corning，Falcon ^®，目录号：352350）
P6孔板（VWR，目录号：734-2323）
40μm尼龙过滤器（Corning，Falcon ^®，目录号：352340）
P12孔板（VWR，目录号：734-2324）
提示补充（VWR，目录号：89079-464; 89079-470; 89079-478）
冷冻筒1ml（Greiner Bio One，目录号：123263）
注射器过滤器0.2μm（VWR，目录号：28145-477）
血清学移液管5ml，10ml和25ml（Corning，Falcon ^{，目录号：357543; 357551; 357535）}
小鼠（在RjOrl：SWISS和C57BL/6JRj背景上测试）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），游离CaCl 2，不含MgCl 2（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：14190- 094）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270）}
Stem Pro Accutase细胞解离试剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：A1110501）}
Matrigel ^{®基底膜基质（Corning，目录号：354234）}
液氮（由液化气供应）
乙醇95-97％（VWR，TechniSolv ^{，目录号：84857.360）}
葡萄糖（Merck Millipore，目录号：1083371000）
Leibovitz的L-15培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11415-049）
500mM EDTA（pH8.0）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15575-038）}
来自牛血清（BSA）的白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A3294）
高级DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12634-010）
庆大霉素50mg/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15750-037）}
100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140-122）的青霉素 - 链霉素混合物}
两性霉素B250μg/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15290-026）}
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25030-081）}
N-2补充100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：17502-048）}
B-27 w/o vit 50x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12587-010）
1 M HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630-056）
乙酰半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A7250）
生长因子
重组鼠EGF（Peprotech，目录号：315-09）
重组鼠Noggin（Peprotech，目录号：250-38）
重组鼠CHO衍生的R-spondin1（R& D Systems，目录号：7150-RS/CF）
Rho激酶抑制剂Y27632（Sigma-Aldrich，目录号：Y0503）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
丙醇-2（VWR，目录号：1.09634.9900）
70％乙醇（见食谱）
1 M葡萄糖（见食谱）
胚胎的中等（见食谱）
DPBS-EDTA 5 mM（参见食谱）
DPBS-BSA 2％-EDTA 2mM（参见食谱）
基础隐窝培养基（BCM）（见食谱）
用于初始播种的ENR培养基（参见食谱）
ENR用于维护的介质（参见配方）
冷冻介质（参见食谱）
脱冻介质（参见食谱）

设备

双目（Motic，型号：SMZ-168）
冷光源（肖特，型号：KL1500 LCD）
剪刀：直尖尖（Fine Science Tool，目录号：14090-09和14084-08）
斜角锯齿镊子（精细科学工具，目录号：11080-02）
标准（精细）尖端镊子（精细科学工具，目录号：11251-20）
微解剖刀（精细科学工具，目录号：15018-10）
带喷嘴的移液器20-200μl和100-1,000μl（VWR，目录号：89079-970和89079-974）
冷冻离心机冷冻离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）
MaxQ ^TM具有适应温度的摇床（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：MaxQ ^TM 4000）}
生物安全柜（Esco Micro Pte，型号：Class II Type A2）
细胞培养箱（37℃，5％CO 2）（BINDER，型号：C150）
倒立式明视野显微镜（Motic，型号：AE31）
Nalgene Cryo先生Frosty先生的冷冻容器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：5100-0050）
超低温立式冷冻机（Thermo Fisher Scientific，型号：Thermo Scientificifc Queue Basic）
冷冻系统K系列（泰勒沃顿，型号：24K）

程序

注意：

关于小鼠和妊娠的一般考虑：动物应在12小时光/12小时黑暗循环的温度（21±1℃）和湿度（55±10％）的控制室内饲养。胚胎期计算为胚胎第0.5天（E0.5），观察妊娠期的日子。早晨，请先从插座上取出男性，这一点非常重要。妊娠之后可以每天称重女性。
除非另有规定，步骤在室温（RT）下进行。

解剖程序和样品的制备
1. 分离培养的胃胎上皮（图1）
  
  图1.步骤A1的总体程序原理图

注意：这些步骤允许将胃胎儿上皮分离成最终在培养物中产生胃胎儿球体的团块或一组细胞。然而，例如，在FACS之后，也可以从分离的单细胞获得胃胎儿球体。在这种情况下，该协议的用户应遵循步骤A2而不是步骤A1（见下文）。

将胃胎儿上皮分离为单细胞（图4）

图4.步骤A2的总体程序原理图
1. 遵循从步骤1a到步骤1o的部分A中描述的协议。
2. 使用表1中所述的体积，在Stem Pro Accutase细胞解离试剂中重新悬浮沉淀。
3. 将每个悬浮液转移到P6孔板，并在37℃下以75rpm搅拌孵育。孵育时间根据初始材料的数量（30分钟至2小时）而变化。建议在倒置显微镜下每15分钟检查解离，并通过机械上下移液（微量移液管P1000）帮助该过程。
4. 当达到单细胞悬浮液时，将其通过40μm的过滤器通入新的管中
5. 将管以300×g离心5分钟，4℃。
6. 除去上清液并将沉淀重新悬浮在2ml冰冷的2mM DPBS-BSA 2％-EDTA溶液中以洗涤。
7. 重复步骤A2f两次。
8. 最后将单细胞制备物重新悬浮在1ml 2mM DPBS-BSA 2％-EDTA中。将细胞悬浮液保持在冰上，并进行染色步骤或在荧光蛋白表达的情况下进行直接分选。建议在分拣前再次将悬浮液通过40μm过滤器。
9. 感兴趣的单细胞最终可以在300×g下离心5分钟，4℃。去除上清液，如果需要，进行离体培养的样品种子。

文化 - 3D
1. 开始前的一般准备工作
  防冻基质胶在冰上等分，并始终保持在冰上，微小的温度变化可能加速不期望的聚合。
2. 将根据步骤A中获得的颗粒的大小为每个样品选择电镀表面和基质胶量。对于从E14-18的胚胎或分选样品获得的各个样品，建议使用12孔的1孔平板和100微升Matrigel每粒。对于在步骤A1之后获得的合并样品，优选6孔板的1孔和每粒子240μl的Matrigel。所有这些估算可能会根据用户的计划和需求而改变。
3. 用足够量的基质胶重新悬浮在管中，并将悬浮液均匀化在冰上
4. 将混合样品/Matrigel悬浮液以一滴水转移到板上。从中心向下拉伸，直到井底不被接触到墙壁（为此目的使用尖端）（图5a）。
5. 将板放在37℃的培养箱中10分钟，直到混合物聚合。
6. 分配用于初始播种的球状体ENR培养基（参见食谱部分）：每孔700μl（12孔板）和1.4ml /孔（6孔板）。
7. 将板放在培养箱中。
8. 应每隔一天使用ENR培养基进行全面的维护（参见食谱部分）。
  
  注意：所有步骤，包括根据样品密度进行电镀的决定，应在倒置的明视野显微镜下进行观察。
  
  图5.球体初始播种。 a。显示3D文化的侧视图和上视图; b。在第6天，胃球体培养的代表性图片，箭头显示球体内的死细胞（b）。刻度棒=100μm。
维持胃球体
1. 开始前的一般准备工作
  培养5〜7天后（取决于生长速率），当细胞内几乎没有死细胞开始积聚在球体内时，应重新进行（图5b）。这可以通过"选择"所选择的元素（放大选定的群体）（步骤C2）或者通过收获井的完整部分（仅仅是文化维护）来完成（步骤C3）。有关每种情况，请参见以下详细信息（图6）。
  
  图6.维持胃球体的程序从Matrigel中分离完全生长的球体，机械解离成小组细胞，然后将其与新的Matrigel等分试样混合并接种。在基质胶聚合后加入ENR播种培养基
2. 按元素选择进行替换
  1. 选择要在倒置显微镜下挑选的元素
  2. 每个样品在室温下用1ml DPBS制备一个管，用微量移液管（P200）从孔中挑取元素（1ml DPBS，12孔板），并用DPBS转移到管中。对所有需要的元素重复此过程。
  3. 以300×g离心管5分钟。
  4. 去除上清液并将元件重新悬浮在0.3ml DPBS中。
  5. 通过用微量吸管（P200）上下移动来机械地破碎元件，直到大块的视觉消失。
  6. 加入1ml DPBS以进一步清洗悬浮液
  7. 以300×g离心管5分钟。
  8. 除去上清液，并将沉淀物重新悬浮在足够体积的Matrigel中，如步骤B所述
  9. 重复步骤B3-B7。
3. 无需选择即可
胃球蛋白冷冻保存
1. 冻结协议
2. 去冻协议

数据分析

在免费访问的原始研究论文（Fernandez Vallone等人，2016年）中提供了重复的细节。

笔记

初次播种时获得的球形产量的产量高度依赖于发育阶段，E14-E15效率较高，随着时间的推移逐渐降低。在后来的发育阶段，可以在生长的元素中获得低比例的透明球体。在这种情况下，胃球体的再次需要从初始板选择性地挑选最清楚的元件，其余部分（通常是黑色球状结构）对应于在ENR培养基中不能有效生长的成体型干细胞。
为了提高细胞分选后的细胞活力，将单个分选的细胞收集在含有10μMY27632的BCM培养基中。
该方案可以类似地用于有效地生长小肠的小鼠胎儿祖细胞，这是最初由Mustata等人（2013）描述的方案。

食谱

70％乙醇
70％乙醇（v/v）在蒸馏水中
1 M葡萄糖
将180克葡萄糖溶于1升蒸馏水中将溶液通过0.22μm过滤器
胚胎中等
将17.5ml 1M葡萄糖（无菌）加入到500ml Leibovitz的1-15培养基中
DPBS-EDTA（5mM）
DPBS中0.5ml 500mM EDTA 最终体积：50 ml
DPBS-BSA 2％-EDTA（2mM）
1克BSA
在DPBS中0.1ml 500mM EDTA 最终体积：50 ml
将溶液通过0.22μm过滤器
基底隐窝培养基（BCM）
500 ml Advanced DMEM/F12补充：
0.4 ml庆方霉素 5毫升青霉素 - 链霉素鸡尾酒库存
5 ml两性霉素B
5ml L-谷氨酰胺（终浓度：2mM）
初始播种的ENR培养基
BCM补充：
0.5 ml N-2
1 ml B-27 w/o vit A
0.5 ml 10 mM HEPES
0.1ml 1mM N-乙酰半胱氨酸
终浓度为50ng/ml的生长因子，EGF为50ng/ml，Noggin为100ng/ml，CHO-衍生的R-spondin为10μMRho激酶抑制剂（Y-27632）为100ng/ml。最终体积：50 ml
用于维护的ENR介质
BCM补充：
0.5 ml N-2
1 ml B-27 w/o vit A
0.5 ml 10 mM HEPES
0.1ml 1mM N-乙酰半胱氨酸
生长因子终浓度为：EGF为50ng/ml，Noggin为100ng/ml，CHO为衍生的R-spondin1为100ng/ml。最终体积：50 ml
冷冻介质
BCM
1 ml FBS
1 ml DMSO
最终体积：10 ml
脱冻介质
BCM
1 ml FBS
最终体积：10 ml

致谢

这项工作得到了比利时国家比利时科学政策（6/14），比利时Fonds de la Recherche科学院，瓦隆地区（计划CIBLES）和非营利协会RechercheBiomédicale的支持et诊断。该协议是从以前的样品制备工作（Mustata等人，2013）和Sato等人的初步报告中进行的。（2009）for ex emitation 培养条件。

参考文献

Barker，N.，Huch，M.，Kujala，P.，van de Wetering，M.，Snippert，HJ，van Es，JH，Sato，T.，Stange，DE，Begthel，H.，van den Born，M ，Danenberg，E.，van den Brink，S.，Korving，J.，Abo，A.，Peters，PJ，Wright，N.，Poulsom，R.and Clevers，H.（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20085740"target ="_ blank"> Lgr5 ^{+ ve}干细胞驱动自我更新在胃中并在体外构建长寿命胃单位。细胞干细胞 6（1）：25-36。
Fernandez Vallone，V.，Leprovots，M.，Strollo，S.，Vasile，G.，Lefort，A.，Libert，F.，Vassart，G.and Garcia，MI（2016）。< a class = ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26989172"target ="_ blank"> Trop2标记了上皮损伤后的过渡性胃上皮细胞和成年再生细胞。 em>发展 143（9）：1452-1463。
Mustata，RC，Vasile，G.，Fernandez-Vallone，V.，Strollo，S.，Lefort，A.，Libert，F.，Monteyne，D.，Perez-Morga，D.，Vassart，G.and Garcia， MI（2013）。识别Lgr5独立球体 - 产生小鼠胎儿肠上皮的祖细胞。 Cell Rep 5（2）：421-432。
Sato，T.，Vries，RG，Snippert，HJ，van de Wetering，M.，Barker，N.，Stange，DE，van Es，JH，Abo，A.，Kujala，P.，Peters，PJ和Clevers， H.（2009）。单个Lgr5干细胞构建隐窝没有间充质生态位的体外结构。自然 459（7244）：262-265。