材料和试剂

96型悬浮细胞U形孔板（Greiner Bio One，目录号：650161）
Filtopur ^{TM注射器过滤器（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）}
50 ml注射器（TERUMO，目录号：SS + 50ES）
12孔直径为10mm的玻璃底部（MATTEK，目录号：P12G-0-10-F）
1.5ml无菌Eppendorf管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
50ml无菌离心管（Corning，目录号：430829）
35毫米玻璃底盘，直径14毫米（MATTEK，目录号：P35G-0.170-14-C）
T75烧瓶用于贴壁细胞（SARSTEDT，目录号：83.3911）
血清移液管（5ml，10ml）（CORNING，目录号：4051和4101）
移液管贴（10μl，200μl，1,000μl）（SARSTEDT，目录号：70.1130.100,70.760.002和70.762.100）
细胞系：MDA-MB-231乳腺癌上皮细胞（ATCC，HTB-26，目录号：MDA-MB-231）;人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（ATCC，CRL-1730 ，目录号：HUV-EC-C）;正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）（Lonza，目录号：CC-2509）
重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（rhTRAIL）（内部纯化），受体选择性TRAIL突变体TRAIL-45（O'Leary等人，2016; van der Sloot 等人，2006）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） - 低浓度葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D6046）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
L-谷氨酰胺溶液，200μm储备液（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
在HBSS中1倍胰蛋白酶-EDTA缓冲液
CellTracker CM-Dil Dye（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：C7001）或CMTPX红细胞跟踪染料（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：C34552）}
大鼠尾巴胶原I型（康宁，目录号：354236）
Hoechst33342-10mg/ml水溶液（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：H3570）}
SYTOX绿色核酸染料（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：S7020）}
通过将EBM-2基础物质加入到EGM ^{TM2单克隆试剂盒（Lonza，目录号：CC-4176）中制备的内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）中等（Lonza，目录号：CC-3156）}
Hanks的平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM目录号：24020117）}
1N NaOH溶液
甲基纤维素溶液（见食谱）

设备

Heraeus ^{TM/sup> Megafuge ^{TM离心机（15ml，50ml管）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：16离心机系列） br />}}}
哺乳动物细胞培养箱（37℃，5％CO 2）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma< S< S<循环^TM）
血细胞计数器
移液管（10μl，200μl，1000μl）
移液管辅助装置
共焦显微镜系统（Andor ^TM，革命旋转盘共焦系统^TM）

高分辨率EMCCD相机（Andor iXon EM +）

奥林巴斯IX81电动倒置显微镜，配有可变温度/CO 2加湿孵化室，用于活细胞实验

横河CSU22旋转盘共焦单元
磁力搅拌器
轨道摇床

软件

Volocity ^TM软件（PerkinElmer）

程序

多细胞混合细胞型球体的生产
1. 使用细胞跟踪剂染料CM-Dil或CMTPX标记MDA-MB-231细胞，通过在暗处37℃下将0.1ml细胞悬浮液与2μM两种染料中的任一种孵育30分钟，每5至10次振荡min。
  注意：根据具体检测的需要，您可能会使肿瘤细胞未染色，并使用相同的程序标记非恶性细胞成分。
2. 通过胰蛋白酶消化获得HUVEC和NHDF细胞。通过以300×g离心5分钟收集1×10 5个HUVEC细胞和0.5×10 5个NHDF细胞，并将细胞沉淀重新悬浮在0.2ml新鲜生长培养基（分别获得0.5×10 6个细胞/ml和0.25×10 6个细胞/ml）。
3. 加入150μl的HUVEC细胞（7.5×10 4个细胞），150μl的NHDF（3.75×10 4个细胞）和75μl的MDA-MB-231细胞（ 7.5×10 4个细胞）加入到含有20％甲基纤维素溶液的15ml EGM-2培养基中（参见食谱）。
4. 向96 U形孔悬浮板的每个孔中加入150μl上述溶液，并在37℃下孵育24小时以允许球形成。
  注意：图1A和1B显示了播种细胞24小时后U形孔和成球（仍然主要是圆形细胞）的单细胞悬浮液的透射光学显微镜图像。
  
  图1.混合细胞型肿瘤微球的形成和形态.A，B和D.（A）在U型孔中接种之后（A）肿瘤球的细胞成分的透射光学显微镜图像，（B）在U形孔中孵育24小时后组装肿瘤球，以及（D）播种后72小时，完全形成的包埋在胶原基质中的肿瘤球。 C.使用5ml血清学移液管从U形孔收集成形的球体。
  注意：将移液管轻轻地放在井的底部并收集内容物。然后将移液管移至下一个孔，而不释放收集的介质。将来自几个孔的移液管中收集的肿瘤球的培养基转移到15ml离心管中（未显示）。
多细胞肿瘤球状体的药物效力检测
1. 通过将大鼠尾部胶原I型稀释成适当体积的EGM-2培养基来制备1.5mg/ml胶原I型原液。通过逐滴加入1N NaOH将pH中和至7.0。使用注射器和注射器过滤器对最终溶液进行过滤消毒。每次准备这个解决方案。
2. 在玻璃底部12孔培养皿的孔的底部加入100μl胶原蛋白原液，其先前在培养箱中温热至37℃。在37℃下孵育30分钟，使胶原蛋白胶凝固。
3. 在24小时孵育结束时，使用5ml或10ml血清移液管从96 U形孔板轻轻收获形成的球体至15ml离心管中，并通过在300℃离心溶液收集球体> xg 5分钟。
  注意：收集步骤的图像如图1C所示。通常，每个孔形成一个球体，尽管它可能因不同的细胞类型而异。
4. 取出培养基，小心不要打扰球状颗粒。加入1,400μl新鲜制备的1.5mg/ml胶原蛋白原液，并通过敲击管的底部小心地重新悬浮球状颗粒。
5. 在12孔板中的每个胶原凝胶上方加入100μl球状体悬浮液，每孔产生5-8个球体。将板置于37℃的培养箱中1小时，以使第二个胶原凝胶层固化。
  注意：凝胶可能需要更长时间才能设置。凝胶设定完毕后不得迟于2.5小时。
6. 向每个孔中加入1.5ml EGM-2培养基，孵育球体24-48h。
  注意：嵌入胶原蛋白的完全形成的球体的透射光显微镜图像如图1D所示。
7. 用适当浓度的药物/药物治疗细胞。
8. 在分析前2小时，向培养基中加入终浓度为1μM的1μg/ml Hoechst33342核染料和SYTOX Green活性染料，并在37℃（2小时）下完成孵育时间。
9. 通过使用共聚焦显微镜监测在CM-DiI/CMTPX标记的肿瘤细胞群体和CM-DiI/CMTPX阴性的非恶性细胞组分中监测SYTOX Green阳性细胞数目来分析细胞死亡的诱导（例如。在0.5μmZ-堆叠平面中拍摄图像，而不事先固定球体）。

数据分析

该方案描述了可用于评估细胞毒性，抗血管生成，细胞抑制以及其他药物功效的肿瘤球的产生。数据分析和统计取决于下游应用，如检测细胞死亡的方法。我们显示的上述例子是基于对死亡细胞的显微检测来评估细胞毒性。分析步骤总结如下：

将40μl胶原-I溶液加入到具有用于显微镜（MatTek Corporation）的14mm载玻片底板的35mm培养皿中，其预先温热至37℃。
然后将培养皿在37℃下孵育45分钟以使胶原凝胶凝固。
将从体积为50μl胶原-I的U形96孔板收获的4-6个球状体加入胶原凝胶顶部的每个培养皿中。
将培养皿置于37℃的培养箱中1-2小时以使第二胶原凝胶包埋肿瘤球。
然后将2ml EGM-2培养基加入每个孔中，将球体孵育48小时。
用250ng/ml浓度的命名为TRAIL45a的死亡配体细胞因子TRAIL的受体选择性突变体处理球24小时。
分析前2小时，将1μg/ml Hoechst33342和1μMSYTOX Green分别加入到培养基中以标记细胞核和染色细胞。
通过用共聚焦显微镜计数SYTOX Green阳性染色/死细胞，无任何球体处理，来测定细胞死亡的诱导。检测步骤如下：
注意：球体的图像在玻璃底部的盘子中进行，不消化胶原基质，酶（或其他）解离球体或用甲醛或其他固定剂固定。 />
使用具有以下组件的Andor ^{TM旋转旋转盘共焦系统}从未固定的球体拍摄图像：Yokagawa CSU22旋转盘共焦系统，四个固态激光线：405nm ，488nm，561nm和640nm;高分辨率EMCCD相机（Andor iXon EM +），奥林巴斯IX81电动倒置显微镜，配有可变温度/CO 2加湿孵化室，用于活细胞实验。使用以下滤光片检测荧光信号：用于Hoecsht33342的360-390nm/420-460nm激发/发射滤光器，用于SYTOX Green的470-495nm/510-550nm激发/发射滤光片和540-550nm/575-625 nm激发/发射滤光片用于CMTPX。
将球形中间部分的Z-叠层图像以600x的总放大倍率（具有60x浸油目标）取为0.5μm切片，然后将其用于产生图2所示的3D复合图像，其中Volocity < sup> TM 软件（Perkin-Elmer）。

代表数据

图2.混合细胞型肿瘤微球中药物功效的检测（A）未处理的肿瘤微球的中间10μm部分的3D重构共聚焦显微镜图像，（B）用工程化的受体 - 重组人TRAIL（DR4和DR5-双特异性; TRAIL-45a）的特异性突变体。蓝色：所有核（Hoechst33342），红色：非恶性细胞：HUVEC和NHDF（CMTPX），绿色：死细胞（SYTOX Green）。比例尺表示10μM。在暴露于250ng/ml TRAIL-45a 24小时之前，将肿瘤小球生长48小时。处理的样品用Hoechst33342和SYTOX Green染色处理的最后2小时。使用Andor ^TM Revolution旋转圆盘共焦系统^TM从未固定的样品中取出图像，其中以600x放大倍率获取为0.5μmZ-堆叠的图像。

笔记

可以使用除MDA-MB-231细胞之外的肿瘤细胞类型，但是它们形成混合细胞型球体的能力/倾向可以显着变化，因此需要测试。通常用于微粒生成的其它细胞类型包括MCF-7和BT474人类乳腺癌细胞（Monazzam等人，2006）。这些单细胞类型球体的产生使用类似的方法将胶原溶液替代为琼脂糖。其他混合细胞型球体涉及使用与成纤维细胞混合的结肠腺癌细胞系，即COLO320HSR和SNU-C1（Park等人，2016）。该协议特别是通过轨道振荡器使用旋转条件来诱导球体的产生。
本协议中描述的球体也可用于监测血管发生（Correa de Sampaio et al。，2012）或细胞迁移/侵袭。

食谱

甲基纤维素溶液
1. 在具有磁力搅拌器的500ml烧瓶中高压灭菌6g甲基纤维素
2. 加入预先加热至60°C的250ml EGM-2培养基至高压灭菌甲基纤维素的
3. 搅拌以促进甲基纤维素溶解20分钟
4. 加入另外250毫升EGM-2培养基温至室温
5. 在4℃下搅拌2小时以完全溶解甲基纤维素
6. 在室温下将最终的溶液以5,000×g离心2小时以除去未溶解的甲基纤维素。
7. 将上清液转移到干净的瓶子中

致谢

ES实验室的研究由爱尔兰科学基金会和爱尔兰癌症协会（BCNI，14/ICS/B3042）提供支持。作者感谢吉利安·墨菲（剑桥大学）教授分享了目前协议所基于的小型协议。

参考文献

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