材料和试剂

Amersham Hybond-N +膜（GE Healthcare，目录号：RPN203B）
保鲜膜
> Amersham Hyperfilm ECL（GE Healthcare，目录号：28906835）
总RNA
Dynabeads ^® mRNA纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：61006）}
无RNase的水
抗 - 抗体（Synaptic Systems，目录号：202 003）
山羊抗兔IgG-HRP（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2004）
ECL Western Blotting Substrate（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：32106）
1×磷酸缓冲盐水（1×PBS），pH7.4
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
不含脂肪的牛奶（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706404）
洗涤缓冲液（见配方）
阻塞缓冲区（见配方）
抗体稀释缓冲液（见配方）

设备

NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：NanoDrop ^{TM 2000/2000分光光度计）}}
热块
Stratalinker 2400紫外线交联剂（Stratalinker）
振动器

软件

ImageJ

程序

mRNA纯化
1. 使用Dynabeads mRNA纯化试剂盒按照制造商的说明书从总RNA中分离mRNA。对于一个斑点印迹测定，我们建议纯化至少20μg的总RNA。
2. 用NanoDrop确定纯化的mRNA的浓度，并使用无RNase的水进行mRNA的连续稀释至50 ng /μl，10 ng /μl和2 ng /μl。
斑点印迹
1. 在95℃下使连续稀释的mRNA变性以破坏热块中的二级结构3分钟。
2. 变性后立即在冰上冷却，以防止mRNA的二级结构重新形成。
3. 将2μl的mRNA直接滴加到用于核酸转移优化的Hybond-N +膜上（图1）
  
  图1.膜上mRNA点的实例
4. 交联通过自交联模式（1,200微焦[x100]; 25-50秒），在Stratalinker 2400紫外线交联剂中将膜上的膜分成两层。
5. 将清洁的洗涤盘中的10毫升洗涤缓冲液中的膜在室温下清洗5分钟，清洗不需要RNase的洗涤盘，轻轻振荡洗涤未结合的mRNA。
6. 在室温下温和摇动，将膜在10ml封闭缓冲液中孵育1小时。
7. 将抗体（1:250稀释;2μg/ml）在抗体稀释缓冲液中于4℃温和摇动过夜孵育膜。
8. 每次洗10分钟洗涤缓冲液，轻轻摇动膜3次，每次洗涤5分钟。
9. 使用山羊抗兔IgG-HRP（1：10,000稀释; 20ng/ml）在10ml抗体稀释缓冲液中在室温下温和摇动孵育膜1小时。
10. 每次洗10分钟10分钟洗涤缓冲液，轻轻摇动膜。
11. 在室温下在黑暗中将3ml ECL Western Blotting底物孵育5分钟。请注意，添加的ECL溶液的体积取决于膜的尺寸。根据制造商的说明书，推荐使用0.125ml ECL溶液/cm 2。
12. 将膜包裹在塑料包装中，并用超薄膜ECL曝光适当的曝光期。
13. 制作电影

数据分析

斑点印迹分析是半定量方法，应用独立生物材料通过上述步骤重复分析。与野生型对照相比，在独立材料中观察到的m ⁶ A水平的可重复变化被认为是"阳性"结果，可以通过其他定量方法进一步研究。此外，斑点印迹图像的信号可以通过ImageJ进行定量，统计分析应至少基于三个生物重复。

代表数据

有关代表性的数据，请参见Shen 等人的论文，2016年。

笔记

如果相应的特异性一级抗体和二级抗体可用，该方案也适用于检测其他类型的RNA修饰。

食谱

洗涤缓冲液
1x PBS
0.02％吐温-20
阻塞缓冲区
1x PBS
0.02％Tween-20
5％无脂牛奶
抗体稀释缓冲液
1x PBS
0.02％Tween-20
5％无脂牛奶

注意：无需使用无RNase的水来准备上述解决方案。

致谢

这项工作得到了新加坡教育部新加坡国家研究基金会调查计划（NRF-NRFI2016-02）的学术研究基金（MOE2015-T2-1-002）和新加坡国立大学的校内研究支持和淡马锡生命科学实验室。

参考文献

Fu，Y.，Dominissini，D.，Rechavi，G.，and He，C.（2014）。通过可逆的m6A RNA甲基化介导的基因表达调控。 Nat Rev Genet 15（5）：293-306。
Shen，L.，Liang，Z.，Gu，X.，Chen，Y.，Teo，ZW，Hou，X.，Cai，WM，Dedon，PC，Liu，L。和Yu，H。（2016）。 N6-甲基腺苷RNA修饰调节芽干细胞命运拟南芥。 Dev Cell 38（2）：186-200。