材料和试剂

0.1-10μl移液管吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：QSP＃TF104）}
1-200μl移液管提示（康宁，目录号：4845）
100-1,000μl移液管吸头（康宁，目录号：4846）
15ml离心管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352096）}
50ml离心管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352070）}
50ml注射器（NIPRO，目录号：4987458089534）
0.20μm消毒过滤器（Advantec MFS，目录号：25CS020AS）
Falcon 12孔组织培养板（Corning，Falcon ^{®，目录号：353043）}
无缝纤维素管（EIDIA，目录号：410490033）
96孔快板（NIPPON Genetics，目录号：38801）
qPCR粘合密封（NIPPON Genetics，目录号：4Ti-0560）
C57/B6起源的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）（E13.5）（Bryja等人，2006）
CD14微珠，人（Miltenyi Biotec，目录号：130-050-201）
根据制造商的说明书，通过用CD14微珠进行磁激活细胞分选，从健康志愿者的外周血中分离初级人类外周单核细胞。
ISOGEN（Nippon Gene，目录号：311-02501）
核酸酶游离H 2 O（作为ReverTra Ace qRT-PCR试剂盒的辅助试剂）（TOYOBO，目录号：FSQ-101）
DNase I（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：18068015）}
EDTA
ReverTra Ace qRT-PCR试剂盒（TOYOBO，目录号：FSQ-101）
SYBR Premix Ex Taq（2x）（Tli RNase H Plus）（TaKara Bio，目录号：RR420）
ROX参考染料（50x）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：12223-012）}
通过定量PCR扩增小鼠TIPARP cDNA的引物（Sigma-Aldrich）：
正向：5'-GCCAGACTGTGTAGTACAGCC-3'
反向：5'-GGGTTCCAGTTCCCAATCTTTT-3'
通过定量PCR扩增小鼠ACTB cDNA的引物（Sigma-Aldrich）：
正向：5'-AGTGTGACGTTGACATCCGTA-3'
反向：5'-GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT-3'
通过定量PCR扩增人TIPARP cDNA的引物（Sigma-Aldrich）：
前进：5'-GTTGGGGACCAGATACCGGA-3'
反向：5'-CTGGGTGCAAAAGATCAGTCT-3'
通过定量PCR扩增人GAPDH cDNA的引物（Sigma-Aldrich）：
转发：5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'
反向：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'
NaCl
NaH 2 PO 4 H 2 O 2/
KCl
CaCl 2
MgSO 4·7H 2 O→//
Fe（NO 3 3）3 2 O
L-精氨酸·HCl
L-组氨酸·HCl·H 2 O
L-异亮氨酸
L-亮氨酸
L-赖氨酸·HCl
L-甲硫氨酸
L-苯丙氨酸
L-苏氨酸
大豆
L-缬氨酸
L-半胱氨酸·HCl·H 2 O
L-丝氨酸
L-酪氨酸
酒石酸胆碱
叶酸
D-Ca泛酸盐
肌醇
烟酰胺（烟酰胺）
吡哆醛·HCl
硫胺素·HCl
核黄素
D-葡萄糖
丙酮酸钠
酚红钠
琥珀酸
琥珀酸二钠
Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（NISSUI PHARMACEUTICAL，目录号：05919）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：21051-024）}
NaHCO 3（KANTO KAGAKU，目录号：37116-00）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10437-028）}
（Kyn）（Sigma-Aldrich，目录号：K8625）和6-甲基吲哚（3,2-b）咔唑（FICZ）（Enzo Life Sciences，目录号：BML-GR206-0100）的储备溶液/>
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（NISSUI PHARMACEUTICAL，目录号：05913）
二甲基亚砜（DMSO）（Dojindo Molecular Technologies，目录号：SP10）
异丙醇（NACALAI TESQUE，目录号：29113-53）
乙醇（99.5％）（NACALAI TESQUE，目录号：14713-95）
氯仿（KANTO CHEMICAL，目录号：07278-00）
不含色氨酸（Trp-free）DMEM（细胞科学与技术研究所，特殊订单）（参见食谱）
DMEM（FBS +）（见食谱）
无Trp的DMEM（FBS +）（参见食谱）
Kyn股票解决方案
FICZ库存解决方案

设备

移液器（PIPETMAN P2）（Gilson，目录号：F144801）
移液器（PIPETMAN P20）（Gilson，目录号：F123600）
移液器（PIPETMAN P1000）（Gilson，目录号：F123602）
生物清洁工作台（日立，型号：1305BNG3-AG）
Labnet VX100涡流（Labnet International，目录号：13111-LV2）
37℃和5％CO 2细胞培养箱（WAKENBTECH，目录号：9000EX）
ABI StepOnePlus ^{TM实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：4379216）}}

程序

用Kyn或FICZ处理（每个样品通常准备一式三份以评估重现性）

将种子MEF或原代人单核细胞以1×10 6个细胞/孔加入到12孔板中，加入500μlDMEM（FBS +），并在37℃，5％CO 2 -incubator。
24小时后，用1ml预热的PBS洗涤MEF一次，并在37℃下与500μl无Trp的DMEM（FBS +）孵育24小时。执行该步骤以在无Trp条件下培养细胞。至少在这些条件下，这种无Trp培养不影响MEFs的生长
取出培养基，并在37℃下将含有Kyn（0,50,100或200μM）或FICZ（0,0.1,1或25nM）的500μl含Trp的DMEM（FBS +）孵育细胞2小时。 br />

为了评估AHR配体的作用，通过qRT-PCR分析了其中一个AHR诱导型基因TIPARP的mRNA诱导，如下所示：
1. 处理AHR配体2小时后，用PBS洗涤细胞，直接加入500μl的ISOGEN溶解。然后根据制造商的方案提取总RNA，并用核酸酶自由-H 2 O调节至1μg/μl。
2. 在该步骤中，通过用DNA酶I处理降解污染的DNA来纯化总RNA。按以下顺序混合：
3. 将混合物样品在37℃下孵育15分钟
4. 向每个样品加入1μlEDTA，并在65°C下孵育样品10分钟。需要这一步来停止DNase I的活动。
5. 接下来用ReverTra Ace qRT-PCR试剂盒合成cDNA，按照以下顺序与试剂盒中包含的每种预混试剂混合：
6. 将混合物样品在37℃孵育15分钟，然后在98℃下孵育5分钟。
7. 对于每个qPCR模板，使用无核酸酶free-H 2 O的cDNA样品进行4倍稀释。
8. 接下来通过qPCR分析评估每个样品中逆转录mRNA，即cDNA的表达水平，其中使用SYBR，DNA结合荧光染料测量扩增DNA的水平，而ROX用作参考染料。设置以下反应混合物以扩增cDNA：
  
  注意：使用1μl核酸酶游离H 2 O或无RT样品代替DNA样品作为阴性对照，以确认程序按预期进行。
9. PCR板用粘合剂透明盖子覆盖，然后立即离心。
10. 在实时仪器中设置板块，并按照以下程序开始实时PCR：

数据分析

通过ΔΔCt方法，将TIPARP mRNA水平标准化为每个样品的ACTB或GAPDH的mRNA表达水平（Schmittgen和Livak，2008）。
两个样本之间的统计学意义由Student's 测试确定。

食谱

不含色氨酸的DMEM

表1.无Trp的DMEM的组成这是由特殊订单（Cell Science& Technology Institute）制备的。
DMEM（FBS +）
补充有DMEM的4mM L-谷氨酰胺，0.1％NaHCO 3和10％热灭活的FBS
无Trp的DMEM（FBS +）

为了从FBS中消耗色氨酸，FBS在4℃下用100倍体积的PBS透析24小时，使用无缝纤维素管与交换透析溶液
无Trp的DMEM补充有4mM L-谷氨酰胺，0.1％NaHCO 3和10％热灭活和透析的FBS

Kyn股票解决方案
Kyn在PBS中以25mM溶解
FICZ库存解决方案
FICZ以DMSO/
中的10mg/ml（35.2mM）溶解

致谢

该协议在Yamada等人的图3b和补充图2g中使用。（2016）基于Opitz等人早期的研究工作。（2011）。这得到了日本卫生部，劳动福利部，日本教育部，文化部，体育部，科技部（赠予援助科学研究（A））[25253030]和赠款的资助，对创新领域的科学研究援助[25115502,23112701]），加藤纪念生物科学基金会，安田医学基金会，武田科学基金会和日本瓦克斯曼基金会对AT

参考文献

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Stockinger，B.，Di Meglio，P.，Gialitakis，M.and Duarte，JH（2014）。芳基烃受体：免疫系统中的多任务。 Annu Rev Immunol 32：403-432。
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