材料和试剂

盖板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：174950）
24孔细胞培养板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：142475）}
细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：153066）
无菌离心管（5ml和50ml）
棉球
移液器尖端
细胞过滤器（40μm）（Corning，Falcon ^®，目录号：352340）
冰
3日龄老鼠
乙醚（Sigma-Aldrich，目录号：346136）
75％乙醇
阿糖胞苷（Sigma-Aldrich，目录号：C6645）
4％甲醛
5％山羊血清
MAP2抗体（Sigma-Aldrich，目录号：M1406）
抗小鼠FITC共轭二抗
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：M9542）
注意：本产品已停产。
胶原蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：C7661）
聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P7405）
HEPES（1 M）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630080）
HBSS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14025092）
木瓜蛋白酶（Worthington Biochemical，目录号：LS003119）
神经基础（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10888022）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：1099141）}
热灭活马血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：26050070）}
B27（50x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：17504044）}
Glutamax（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：35050061）
青霉素/链霉素（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
胶原储备溶液（参见食谱）
聚-D-赖氨酸（PDL）储备溶液（参见食谱）
涂层溶液（见配方）
HBSS + HEPES溶液（参见食谱）
木瓜蛋白酶溶液（参见食谱）
文化媒体（见食谱）

设备

手术剪刀（斩首/解剖脊柱从身体）（RWD生命科学，目录号：S14014-14）
钝镊子（解剖/保持脊柱）（RWD Life Science，目录号：F13017-12）
长而窄的弹簧剪刀（解剖脊髓/切割神经根）（66视力，目录号：54053B）
小型弹簧剪刀（切割硬脑膜）（精细科学工具，目录号：15000-02）
Microforceps（控制脊髓/修剪硬膜）（世界精密仪器，目录号：14098）
手术刀＃15灭菌手术刀（切脊髓隔离背角）（上海金环医疗，目录号：YY0174-2005）
组织文化罩（苏州安泰航空，型号：SW-CJ-1F（D））
立体显微镜（OLYMPUS，模式：SZ61）
台式离心机（4℃，50ml管）（Eppendorf，型号：5430R）
移液器（Eppendorf，型号：ES-1000）
血细胞计数器（上海安新光学仪器制造，型号：XB-K-25）
可堆叠的CO 2培养箱（Eppendorf，型号：Galaxy 170R）

程序

选择三只3只老鼠。
涂层盖玻片与PDL /胶原/水涂层溶液。

将盖玻片置于24孔细胞培养板中，每片1片。在每个孔中加入500μl涂层溶液。这个过程是在引擎盖下完成的
在孵育箱（37°C）孵育1-3小时。
转移到罩盖30分钟到1小时。
丢弃多余的溶液，然后让盖玻片在罩内空气干燥。

准备（这个过程在细胞培养室外面）

将5个装有4ml冰冷HBSS + HEPES溶液的小型培养皿（35mm）放在冰上进行背角组织分离。
在冰上准备约20毫升冰冷的HBSS + HEPES溶液进行细胞洗涤
预孵育后的木瓜蛋白酶溶液在5ml培养箱中进行组织消化
预热培养箱中20ml等分的培养基。

脊髓背角解剖（视频1，这个过程是在细胞培养室外面做的）。在棉球上加入1ml二乙醚，并将其放入50ml管中。把动物放进管子里。动物停止移动后取出。用75％乙醇喷洒动物，在深二乙醚麻醉下用手术剪刀斩首
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视频1.脊髓背角解剖

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剪下背部皮肤，分离脊柱。

用钝钳钳住脊柱。
拉起柱子，将脊柱的中线和连接到柱的腹侧组织切开肋骨。从头开始，进步。
在最尾端穿过脊柱进行横切，释放整个脊柱。

将立体显微镜下将解剖后的脊柱放入含冰冷HBSS + HEPES溶液的培养皿中。排列柱，使腹侧朝上，朝向端向右（图1）。

图1.孤立的脊柱。 A显示背侧视图。腹侧有更多的肌肉。 B显示腹侧视图。肋骨附在柱上。
腹侧"椎板切除术"

用大型剪刀切断椎骨。从头端开始，朝向尾端移动。替代切割椎骨的左侧和右侧。在切割过程中，将一把剪刀插入椎管内，使剪刀向下并横向离开绳索。然后使用剪刀的尖端抬起脊柱的腹盘。丢弃那块椎骨和附着的组织（图2）
重复该过程，直到脊髓的腹面露出

图2.进行腹侧"椎板切除术"。 A和B.将脊骨从头端切断到尾侧。

沿着绳索的背侧，用大型剪刀切断连接的神经根。始终将剪刀向下并远离电线（图3）。用弹簧剪刀的封闭尖端将脊髓轻轻地从脊柱上释放。丢弃脊柱和其他组织。

图3.切割附着的神经根（A）并分离绳索（B）
将电线放入带有冰冷HBSS + HEPES溶液的新培养皿中。将脊髓的前端放在前面（根据从脊髓伸出的神经根的方向判断尾部和尾端），背侧是上（在血管的表面中部可见血管背侧）（图4A）

图4.隔离和切割脊髓 A.在背侧表面的中间可以看到血管（由红色虚线标记）。神经根的方向（黄色箭头）从脊髓延伸到尾端。 B.沿着中线剪下脊髓，使内侧面朝上。 C.将大约1/4的脊髓部分从尾部切割成流鼻血。
用小弹簧剪刀沿着绳索的中线穿过硬脑膜。

使用微型压缩机的封闭尖端轻轻按压电线背面。（确保电线位于菜肴的底部，否则将难以操作和切片。）
从尾端切开在切割时，将剪刀下的一个刀片（只有尖端）插入硬脑膜，轻轻抬起硬脑膜，以免损坏电线。
切割"向前"（朝向末端），滑动剪刀，同时滑动微型锚杆。
用微型力量修剪附着在电线背面的硬膜。

用手术刀沿着中线（尾状罗斯托轴）切割脊髓（图4B）。使用微型推杆的两个尖端轻轻地固定绳索的两侧，并从尾部切割到长颈鹿。
解剖背角

取脊髓的一半，将腰部的侧面向下，内侧朝上（图4B）。
将大约1/4的脊髓背部切割成尾部。
对于正确的半切线，用左手握住微型手柄，并用右手从尾部到长柄手术，小心切开手术刀（图4C）。
对于左半球线，将其旋转并从头端切割到尾部。
丢弃腹侧脊髓的剩余¾
将解剖的背角条放入含有冰冷HBSS + HEPES溶液的新培养皿中

注意：以下步骤在引擎盖中完成。

收集所有背角条后，将其转移到装有木瓜蛋白酶溶液的5ml管中（步骤3c）。
在CO 2培养箱中37℃消化30分钟（每5或10分钟旋转）。
用1-2ml冰冷的HBSS + HEPES溶液通过吸液（不抽吸组织）洗涤。将管架放置2分钟，让组织下降。丢弃液体。
重复洗涤两次。
用1ml培养基洗涤剩余的组织。
尽可能多地丢弃液体，再添加1ml培养基
用1毫升火焰抛光的移液器尖端（将移液管的尖端放在管壁上，轻轻吸取可见的部分，避免产生任何气泡），然后静置2-3分钟，研磨6-7次。 br />
收集约600μl上清液，并用40μm细胞过滤器过滤收集的上清液。
重复步骤9-12，总共收集约3ml，将过滤的上清液放入50ml管中
在4℃下以1,000×g离心5分钟，并除去尽可能多的上清液。
加入1ml培养基以重悬细胞
使用血细胞计数器计数细胞，并用培养基将细胞密度调节至5×10 5/ml。
将200μl上清液放在涂覆的盖玻片上。
在37℃下孵育60分钟，然后检查贴壁细胞并丢弃悬浮细胞，向每个孔中加入1ml培养基（用于24孔板中的盖玻片）。
在第1天更换文化媒体（取代一半的文化媒体），然后每2天（全部更换）。
播种两天后，将阿糖胞苷（10μM，一次）加入到培养基中并保持24小时以减少胶质增生。
使用细胞进行进一步的实验（图5）

图5.用于评估7天后脊髓背角神经元原代培养物的纯度的免疫细胞化学。MAP2（神经元标记，绿色）和DAPI（核标记，蓝色）的双重染色显示大多数培养的细胞是神经元

数据分析

为了评估脊髓背角神经元的原代培养物的纯度，使用免疫荧光的双染色。 7天培养细胞用4％甲醛固定20分钟，并在室温下用5％山羊血清封闭2小时。然后在4℃下用小鼠抗MAP2抗体（1:500）孵育过夜，并在室温下用抗小鼠FITC缀合的二抗（1：1,000; Jackson ImmunoResearch）孵育1小时。免疫染色后，在室温下，在培养板中加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（0.1μg/ml）5分钟，染色细胞的所有细胞核（Jiang等，。，2016）。

食谱

胶原蛋白溶液
在无菌双蒸水中补充2 mg/ml 等分并储存在4°C
聚-D-赖氨酸（PDL）储备液
在无菌双蒸水中补充0.1 mg/ml 等分并储存于-20°C
涂层溶液
0.2 mg/ml胶原蛋白
10μg/ml聚-D-赖氨酸
用无菌双蒸水稀释储备溶液（食谱1和2）
HBSS + HEPES解决方案
将5ml HEPES（1M）加入到500ml HBSS中，并分装到50ml管中
木瓜蛋白酶解决方案
加入45μl木瓜蛋白酶至3 ml HBSS + HEPES溶液
文化媒体
补充有2％胎牛血清，2％热灭活马血清，2％B27,2mM谷氨酸和1％青霉素 - 链霉素的神经基础

致谢

小鼠脊髓背角神经元方案的原代培养由中国国家自然科学基金资助（NSFC 31371121,81400915和31671091）。该协议是由Jiang等人发表的文章，2016年开发和使用的。

参考文献

Hu，H.J.，Glauner，K.S。和Gereau，R.W。（2003）。 ERK将PKA和PKC信号整合在表面背角神经元。 I.调制A型K ⁺电流。神经生物体90（3）：1671-1679。
Hugel，S.和Schlichter，R。（2000）。突触前P2X受体促进培养的大鼠脊髓背角神经元之间的抑制性GABA能传递。 Neurosci 20（6）：2121-2130。
江，BC，曹，DL，张，X，张，ZJ，他，LN，李，CH，张，WW，吴，XB，Berta，T.，Ji，RR和高，YJ（2016） ; CXCL13通过CXCR5驱动脊髓星形细胞激活和神经性疼痛。 a> J Clin Invest 126（2）：745-761。