材料和试剂

双刃刀片（Everychina，Baili，目录号：BP005）
无菌21号针头（BD，目录号：305165）
注射器（½ml，3 ml和20 ml）
½ml（COVIDIEN，目录号：8881600004）
3 ml（BD，目录号：309657）
20 ml（BD，目录号：302830）
胶带
剥离模式（Sigma-Aldrich，目录号：E6032）
一次性转移移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：336）
六井多（Thermo Fisher Scientific，目录号：130184）
石蜡膜
盖玻片（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-545-88）
70μm细胞过滤器（Corning，Falcon ^{®，目录号：352350）}
15毫升和50毫升聚丙烯锥形管（Corning，Falcon ^{，分别），目录号：352095和352098）}
移液头（10μl，200μl，1,000μl）（USA Scientific）
1至2个月龄的CX 3转基因小鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：005582）
氯胺酮和赛拉嗪（由纽约大学医学院，DLAR提供）
异氟醚（由纽约大学医学院，DLAR提供）
70％乙醇
低熔点琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9414）
氰基丙烯酸酯（Instant Krazy glue）
溴化乙锭（MW：394.3）（MP Biomedicals，目录号：802511）
碘化丙啶（MW：668.4）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：P3566）}
磷酸盐缓冲盐水（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190-144）}
Triton X-100,100ml溶液（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3294）
正常山羊血清（Vector Laboratories，目录号：S1000）
可选：鸡抗GFAP（EMD Millipore，目录号：AB5541）
Mowiol ^{®4-88（水性载体介质）（Sigma-Aldrich，目录号：81381）}
吐温20
可选择：alexa fluor 647-共轭山羊抗鸡IgY-H& L（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A21449）二抗
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7528）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S8282）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
HCl
NaOH
EDTA
多聚甲醛（PFA，32％溶液）（Electron Microscopy Sciences，目录号：15714）
人造脑脊液（ACSF）（见配方）
Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +} free-ACSF（见配方）
3-4％PFA，pH = 7.4（参见食谱）

设备

压缩气罐5％CO 2，95％O 2
Leica vibratome和刀架（Leica，型号：VT1000 S）
标准1000轨道振动筛（TROEMNER，目录号：980173）
数字pH计（Mettler Toledo）
止血钳（World Precision Instruments，目录号：503736）
镊子12厘米长（世界精密仪器，目录号：14226）
精细切割钳5号（Roboz手术器械，目录号：RS-4955）
SuperCut剪刀（世界精密仪器，目录号：14218）
脊骨剪刀（Dumont，目录号：15a）
数字水浴（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ^{TM，型号：Isotemp 205）}
油管
数字秤（Mettler Toledo，型号：MS104S）
微量给药（Gilson，0.5-2μl，1-10μl，10-200μl，1,000μl）
具有LED灯的立体显微镜（Olympus，型号：SZX10）
蔡司700共焦显微镜配备了20倍客观和适当的过滤器
热敏电阻温度计（SP科学软件 - 贝尔艺术产品 - H-B仪器，目录号：605010100）

程序

切断脊髓前

气泡（混合物95％O 2/5％CO 2）将500ml正常ACSF和50ml Ca 2+/Mg和Mg在4℃下30分钟的自由ACSF进行30分钟。
30分钟后监测pH值。 pH值将接近7.38-7.40;必要时调整为7.38-7.42。
将剃刀刀片的一半插入振动片的刀架中，并通过将冰放置在冰室中来冷却舞台。

使用氯胺酮（100mg/kg）/赛拉嗪（15mg/kg）腹膜内注射深度麻醉小鼠。
注意：或者，异氟醚可用于诱导麻醉。
用70％乙醇喷洒胸部和腹部，通过纵向中线切割进入腹腔。打开胸腔暴露心脏（使用SuperCut剪刀和12厘米长镊子）。（图1a-1d）
用镊子握住心脏，并将21号针插入左心室。
注意：请勿将针头插入太远，否则可能会损坏内部心室并损害液体的循环。
用95％O 2饱和的冷冻Ca 2+ +和/或自由ACSF缓慢地切成右心房和灌注小鼠，/5％CO 2通过左心室（20ml /小鼠，体重：10-15g）。

图1.提取小鼠脊髓的外科手术。 a。用胶带将手术台上的深度麻醉的小鼠限制在手术台上。 b和c。中线切口用于开始剖腹术。 d。胸腔开放e。插入21-G针穿过左心室进行灌注，切割右心房。 f和g。通过切开背脊椎过程，打开椎管并将椎体切除到腰椎。 H。从腹侧观察脊髓暴露的胸段。
灌注后，取出小鼠，取出脊柱，迅速将其浸入正常冰冷的ACSF中
做两个小切口，每一侧在颈椎端。开始使用特殊的骨头剪刀去除腹侧椎体（颈部到腰部），以切割两侧的背部过程（Dumont，15a）。该程序将打开椎管，切开神经并暴露脊髓（图1f-1h）。
用镊子和精细剪刀小心地取出脊髓，并将其浸入95％O 2/5％CO 2饱和的冷冻正常ACSF中。
注意：在此过程中，请避免拉伸和挤压电线。
用精细剪刀切割靠近绳索的剩余脊髓神经根。
将脊髓保持在95％O 2/5％CO 2饱和的冰冷ACSF中，直到在步骤12中嵌入电线。
通过在微波（<1分钟）内加热，溶解低熔点琼脂糖（ACSF中4％）。
用琼脂糖填充一次性嵌入模具（22 x 22 x 20 mm），并将模具冷却至冰上。当琼脂糖温度低于37℃时，嵌入胸椎或腰脊髓（图2b）。在此温度稍低的条件下，琼脂糖是半固体的，并且可以将水平线嵌入。
将包埋的模具保持在冰上，直到琼脂糖变固。
注意：
1. 一旦模具放置在冰上，琼脂糖凝胶将在约3-5分钟内完成。
2. 步骤10-14不应超过5-10分钟。
将琼脂糖模具尽快放在用95％O 2/5％CO 2饱和的冰冷的ACSF中。
将少量氰基丙烯酸酯加入到振动台中，从模具中取出琼脂糖块并将其粘合到载物台上。在整个切片期间，将嵌入的脊髓立即浸入冰冷的ACSF（具有95％O 2/5％CO 2混合物的气泡）。（图2a-2c）

图2.脊髓切片的实验设置。 a。震颤b。脊髓段水平放置在琼脂糖模具中; C。将包含脊髓的琼脂糖立方体从模具中取出，旋转90°，并以正确的方向胶合到振动台，用于冠状切片。
剖面脊髓在250-300微米的切片中，Leica vibratome（VT1000 S）分别为0.1 mm/sec和70 Hz，叶片的截面平均速度和频率。
注意：使用更快的速度将阻止正确的脊髓切片。在继续使用精细的刷子去除切片周围的琼脂糖之前。
使用转移移液管或细刷将切片取出并将其放入细胞过滤器中，将其浸入含有250ml饱和95％O 2/5％CO 2的ACSF玻璃Pyrex烧杯中，/sub>。允许切片在35°C下恢复45-60分钟。
染料吸收实验
1. 在dH 2 O中制备1mM溴化乙锭（EtdBr）和1mM碘化丙啶（PropI 2/2）的储备溶液。
2. 在95％O 2饱和的ACSF中，室温下将10μMEtdBr（用于研究半通道活性）或5μMPropI 2（用于测试细胞活力）亚> 5％CO 2 。添加到ACSF中的EtdBr和PropI ₂的体积不会显着改变电解质的浓度。
  注意：该步骤可以在装有ASCF（2ml /孔）的6孔多孔板中进行。从细胞过滤器中取出切片（参见步骤17），使用转移移液管将其置于6孔多孔中。每个井都必须用Parafilm覆盖，以减少O ₂ /CO ₂
3. 通过在室温下用1ml PBS冲洗切片3次，除去未结合的Etd ⁺或PropI ₂。在室温下将切片固定2小时或在4℃下用4％多聚甲醛（PFA）在PBS中过夜。
对于GFAP的免疫染色（可选）
1. 在室温下在振荡器中将Triton X-100（1％PBS中）标记的片段和Etd ⁺标记片段在振荡器中渗透稳定。
2. 为了阻止非特异性抗体反应，用0.4ml含有5％驴血清，0.5％BSA和0.1％Triton X-100在PBS中的封闭溶液孵育切片0.5小时。
3. 用0.4ml鸡抗GFAP（1/200封闭溶液）孵育切片1小时
4. 去除抗体溶液，并在振荡器中用1ml洗涤溶液（0.5％Tween 20,0.1％Triton X-100，PBS中）孵育切片10分钟。重复洗涤3次。
5. 孵育1小时与山羊抗鸡共轭Alexa-647（1/1,000在阻塞溶液）。
6. 重复步骤19d。
使用水基安装介质在盖玻片上安装切片，例如Mowiol 4-88。
使用一个或两天后的共焦图像，方便，使用配有20x物镜和适当过滤器的Zeiss-700共聚焦显微镜（图3）。
注意：在摄影和成像之间的这个时间段内，Etd ⁺ 标签不会明显减少。

图3.脊髓腹角神经胶质细胞和神经元的支持物和Etd ⁺的摄取。（左图）切片用4％PFA固定过夜，透化，然后在5μMPropI 2中孵育10分钟并安装。运动神经元（红色箭头）和小胶质细胞（绿色箭头）分别通过EGFP的形态学和EGFP表达分别在由CX3 EGFP/+ /老鼠。在这些切片中，CX3/CR1和表达EGFP的细胞是脑驻留巨噬细胞，大多数是由小胶质细胞组成的群体。（中图和右图）在单独的实验中，切片在切片之后1小时保持在饱和95％O 2/5％CO 2的ACSF中，并与5μM PropI 2或10μEEtdBr 10分钟，不进行透化，漂洗，然后固定在4％PFA中，然后再安装。在这些条件下，在神经元（红色箭头）和小神经胶质细胞（绿色箭头，中间面板）中几乎没有支持物的吸收。相比之下，在CX3 EGFP/+小胶质细胞中观察到Etd ⁺摄取（白色箭头，Etd ⁺摄取加EGFP表达），尽管在运动神经元中是罕见的（可识别为没有小红细胞的右侧黑色区域，右图，与左图相比）。 EGFP ^- Etd ⁺细胞和周围运动神经元之间的小红细胞是星形胶质细胞，如GFAP免疫标记所示（参见Garré等人， 2016）。比例尺=50μm。

由于连接蛋白43（Cx43）和pannexin 1（Px1）形成的半通道（HC）的开放已被证明与不同细胞培养系统中增强的Etd ⁺摄取相关（例如< em>，Contreras等人，2003和Garré等人，2010），我们使用这里描述的用于评估响应于炎症攻击的HC活性的制剂。使用遗传和药理学方法，我们显示Px1 HC开放介导对FGF-1和ATP的早期炎症反应。此外，我们确定了Px1 HCs引发的几种炎症机制（参见Garré等人，2016年）。

数据分析

用于分析染料摄取实验的统计数据的完整描述在Garré等人（2016）中提出。

笔记

由于用于该制剂的小鼠在CX3C1细胞（小神经胶质细胞和血管周围巨噬细胞）中表达EGFP蛋白，因此脊髓部分暴露于激发光应该被最小化。它可能会影响EGFP ⁺细胞的数量以及荧光信号的质量。
已经在从小鼠皮层制备的切片中观察到小神经胶质细胞和星形胶质细胞活化的快速表现（Takano等人，2014）。在我们的手中，脊髓切片后2小时，我们还没有看到小胶质细胞或星形胶质细胞活化的明显形态学迹象，最长时间测试。基底膜TNFα水平在切除小胶质细胞的切片中显着降低（Garré等，2016）。为了提高我们协议的重现性，我们建议您记录切片使用多长时间。
如果这种制剂用于电生理记录和/或在切片后2小时以上的时间段，可以使用制备富集的ACSF的替代方法（见Mitra和Brownstone，2012）。

食谱

人造脑脊液（ACSF）
注意：建议采用新鲜的配方。
119.0 mM NaCl
26.2mM NaHCO 3
11.0 mM葡萄糖
2.5 mM KCl
1.0mM NaH 2 PO 4
2.5mM CaCl 2
1.3mM MgCl 2
使用2 N HCl或5 N NaOH调节pH至7.4，分别降低或提高pH值测量渗透压（300-310 mOsm）
过滤解决方案
Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +} free-ACSF
119.0 mM NaCl
26.2mM NaHCO 3
11.0 mM葡萄糖
2.5 mM KCl
1.0mM NaH 2 PO 4
5.0 mM EDTA
使用2 N HCl或5 N NaOH调节pH至7.4，分别降低或提高pH值测量渗透压（300-310 mOsm）
过滤解决方案
3-4％PFA，pH = 7.4
在Ca 2+ +和/或无游离PBS（Thermo Fisher Scientific）中稀释浓缩的32％PFA储备溶液（Electron Microscopy Sciences），使溶液3-4％ PFA，pH = 7.4

致谢

这里的协议改编自Garré等人。（2016）。这项工作得到美国国家卫生研究院NS45287和NS55363对M.V.L.B的支持。和NS072238给F.F.B.，National Institutes of Health Grants GM107469和AG048410给G.Y.立陶宛研究委员会MIP-76/2015至F.F.B.

参考文献

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