材料和试剂

1.8毫升Nunc（或类似的）冰箱
BD Vactuainer 单核细胞制备管（CPT ^TM），8ml用肝素钠（BD，目录号：362753）
P10和P200移液器吸头（任何供应商）
P10和P200机械移液器（任何供应商）
50ml Falcon（或类似）锥形聚丙烯管
血清移液管（各种体积）
BioCision CoolCell ^{®（BioCision，目录号：BCS172） - 无酒精控制速率的冷冻容器}
泡沫包装材料和运输集装箱
磷酸盐缓冲盐水（PBS），Ca 2+ +和/或不含游离的（例如，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM） sup>，目录号：10010-023）
台盼蓝（例如，GE Healthcare，Hyclone ^{TM，目录号：SV30084.01或Sigma-Aldrich，目录号：93595）}
人AB血清（例如，，Valley Biomedical，目录号：HP1022）
二甲基亚砜（例如，Sigma-Aldrich，目录号：D8418）

设备

能够达到1,800 x g（例如Beckman Coulter，型号：Allegra X-14系列）的速度的离心机

移液枪（任何供应商）
自动细胞计数器或显微镜和血细胞计数器（任何供应商）
注意：细胞计数方法的不同细胞类型的吞吐量，成本和灵活性有所不同。为了一致性，在整个研究中应该使用相同的计数方法。
生物安全柜A2级（BSC）（任何供应商）
-80°C冷冻机（用于初始冷冻保存）（任何供应商）
液氮（LN 2）冷冻器（用于长期冷冻保存）（任何供应商）
注意：LN ₂ 系统范围从小而简单到高度自动化。推荐使用自动填充和自我监测系统，特别适用于较大的研究。

程序

等分试管准备
打印包含研究名称，研究编号，未确定的患者编号和访问号码的标签，并粘贴在冰箱上。
样品制备

通过温和倒置几次混合血液以确保均匀的悬浮液。
在室温下以1,800×g离心管20分钟（制动器可以打开）。确保管子可以摆动铲斗配置清除转子;一些管道位置可能导致与转子碰撞并导致破裂的管道。
如果运送到另一个地点，请保护泡沫，并通过同一天或隔夜快件在室温下运送到加工实验室。
注意：在4°C（或湿冰）下运送样品可导致血小板活化和其他不必要的生理和表型变化。

PBMC隔离

在BSC中，轻轻地将CPT管反转数次，然后将血浆和PBMC移液到无菌的50ml锥形管中。
用PBS填充含有血浆和PBMC的管，最终体积为50ml。在室温下以250g离心10分钟，制动器打开。
小心吸出上清液，不会干扰细胞沉淀。
1. 巴斯德吸管和真空可用于抽吸以及用血清移液管和移液枪进行手动吸气。
轻轻地将细胞重新悬浮在10ml PBS中，并取出等分试样以进行细胞计数。使用台盼蓝排除的显微镜使用10μl样品，或自动细胞计数器所需的量。
取出等分试样进行计数后，用PBS将管填充至最终体积为50ml，并用制动器在250 x离心10分钟。

确定等分试样的数量

根据您的细胞计数方法（手动或自动计数器），确定细胞的总量。这将用于计算多少等分的PBMCs被冻结。
细胞应该在每毫升冷冻介质中约10个细胞/个细胞中冷冻;当总细胞计数除以10 ⁷时，结果是等分试样的总数。
将适当数量的冰箱放在冰上或在4°C的冷却架上开始冷冻小瓶以准备冻结。

确定冷冻介质的体积
1. 冷冻媒体分为两部分："A"和"B"。部分'A'由100％人AB血清组成，部分'B'由80％人AB血清和20％DMSO组成。
  注意：使用前必须先将人AB血清热灭活。
2. 您的样品将在部分'A'和部分'B'的50:50混合物中冷冻，总计最终浓度为10％DMSO。
3. 每个等分试样将具有1ml的冷冻介质。将您的总数等于一半，以确定您需要的每个媒体的数量。
4. 将冰箱的两部分放在冰上（或4℃），直到使用。
冷冻PBMC分批（用于可行的冷冻保存）

从细胞中吸出上清液，并在步骤5c中计算出的体积"A"重新悬浮它们。
以大约每秒1滴的速度，在样品旋转的同时，添加必要的"B"体积。
不要重新冻结未使用的"B"媒体。
加入所有的冷冻介质后，将样品上下移动几次，以确保重新悬浮。超移液会导致细胞破裂。
注意：通过这一过程，通过加热DMSO对PBMC有毒性，这一点很重要。
将1ml细胞悬浮液加入每个预先冷冻的冷冻瓶中，并将小瓶放入CoolCell或Frosty先生。
将细胞置于-80°C冷冻箱中24 h。
24小时后，将细胞移至长期的LN 2冷冻箱。
注意：PBMC可以在-80°C保存数天甚至数周，然后转移到LN 2 ;然而，在-80℃下，存储和存储功能逐渐丧失。而且，-80℃（或干冰）和LN 2之间的重复循环将对生存力和功能产生不利影响。因此，如果电池要在干冰上运输，最好将它们短时间存放在-80°C，然后运送到LN <2>。

数据分析

PBMC分离方案的典型评估包括监测产量和纯度。在某种程度上，后者可以视觉上确定，因为红细胞污染将使离心后获得的PBMC颗粒变红。有时在CPT中可以看到这一点，比传统的Ficoll协议更大。然而，这些污染性红细胞在下游操作如冷冻保存后会丢失，并没有被观察到影响功能（Ruitenberg等人，2006）。
产量可以通过手动或自动细胞计数轻松确定，并且据报道在CPT和手动Ficoll方法之间大致相当（Ruitenberg等人，2006）。从我们自己实验室的一个研究中，图2中显示了一个例子。

代表数据

图2.来自CPT的细胞恢复与常规Ficoll程序的比较（使用SepMate管，Stem Cell Technologies）。数据来自两个不同的研究，一个绘制4 x 8 cc CPT，另外4 x 10 cc肝素钠管。由于不同的最大抽取体积，SepMate研究的血容量范围更广;但回收细胞/ml与CPT和SepMate管非常相似。只有样品处于良好状态（没有可见的聚集或红细胞污染），具有>包括20cc血容量进行比较。

笔记

运输温度当在多站点研究的背景下使用CPT时，我们已经看到，当管子在运输过程中变得太冷时，凝胶塞会松动，并且细胞分离可能会失败。因此，强烈推荐使用绝缘运输容器，特别是在寒冷的冬季气候中
离心步骤一致。类似地，当涉及多个位点时，确保成功的关键是在具有潜在不同仪器的站点上计算和实施正确的离心力G力。旋转时间和G力都是成功的重要手段。

致谢

我们感谢BD Biosciences开发本协议所基于的CPT方法。

参考文献

Corkum，C.，Ings，D.，Burgess，C.，Karwowska，S.，Kroll，W.and Michalak，T。（2015）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26307036"target ="_ blank">由Vacutainer细胞制备管（CPT ^{TM）分离的人PBMC的免疫细胞亚群及其基因表达谱，以及标准密度梯度。
BMC Immunology 16:48。}
Ruitenberg，JJ，Mulder，CB，Maino，VC，Landay，AL和Ghanekar，SA（2006）。 VACUTAINER CPT和Ficoll密度梯度分离在维持来自HIV血清阳性血液样品的PBMC的质量和功能方面相当地进行。 BMC Immunol 7：11 。
Schlenke，P.，Klüter，H.，Müller-Steinhardt，M.，Hammers，HJ，Borchert，K.and Bein，G。（1998）。评估血清学HLA分型的新型单核细胞分离程序。临床诊断实验室免疫 5（6）：808-813。