材料和试剂

12孔组织培养（TC）处理板（Corning，目录号：3513）
GeneMate 1.7ml微量离心管（BioExpress，目录号：C-3262-1）
提示
Lightcycler 96孔qPCR板（Roche Molecular Systems，目录号：04729692001）
电池升降机（Corning，目录号：3008）
HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
纯化的单链AAV（任何血清型）（Grieger等人，2012）
1x PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190144）}
DNeasy血液和组织试剂盒（QIAGEN，目录号：69504）
分子级水（Mediatech，目录号：46-000-C）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11995065）
胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25300054）}
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442）
100x青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
FastStart Essential DNA Green Master Mix（Roche Molecular Systems，目录号：06402712001）
病毒特异性qPCR引物（每个工作浓度为20μM）

fLuc-F - AAAAGCACTCTGATTGACAAATAC
fLuc-R - CCTTCGCTTCAAAAAATGGAAC

人基因组qPCR引物（每个工作浓度为20μM）

hLB2C1-F-GTTAACAGTCAGGCGCATGGGCC
hLB2C1-R - CCATCAGGGTCACCTCTGGTTCC

10 ng /μlCBA-fLuc质粒原液（见配方）
100 ng /μlHeLa基因组DNA储备溶液（见配方）

设备

移液器
生物安全柜
CO 2组织培养培养箱（NuAire，型号：NU-5500）
台式离心机（Eppendorf，目录号：022620401）
Lightcycler 96 qPCR仪器（Roche Molecular Systems，目录号：05815916001）
PCR板微量离心机（VWR，目录号：89184-608）

程序

虽然描述了使用HeLa细胞，但是可以使用任何细胞类型，只要细胞在几次冷PBS洗涤后保持连接到平板上即可。如果使用其他细胞类型，则qPCR步骤将需要适当的基因组DNA控制。另外，如果使用非人细胞，则需要设计，测试和使用一组mLamin引物（或其他基因组对照）并用于qPCR步骤。
描述了包装fLuc转基因的病毒包装，只要设计，测试和使用转基因特异性qPCR引物，就可以使用任何转基因。
由于结合和内化测定是分开的，因此使用的孔数必须加倍。一半的孔将用于结合测定，另一半的孔将用于内化测定。

用于病毒结合和内化测定的细胞制备
1. 种子12孔TC板，1e5 HeLa细胞/孔（图1），使孔达到1毫升的最终体积。允许4-6小时使细胞在37℃下在组织培养箱中的5％CO 2中完全粘附到板上。
  注意：如果要用小分子处理细胞，在4℃孵育之前用化合物和载体对照处理细胞。在进行此测定之前，需要确定任何小分子所需的孵育时间。
2. 在4℃孵育细胞30分钟
3. 通过仔细将病毒移入孔边缘附近的培养液的半月板，以感染复数（MOI）1e3载体基因组每个细胞（vg /细胞）感染细胞，注意不要刮掉孔表面。用手慢慢摇动板块混合。
  注意：
  1. 如果AAV的库存浓度高度浓缩，则病毒可以在感染前在DMEM中稀释。
  2. 可以修改MOI以适应个人需要。
4. 在4℃下孵育细胞1小时，以使病毒与细胞表面结合
5. 用400μl冰冷的PBS轻轻洗涤细胞3次以通过将板倾斜向上移动未移除的病毒，并用移液管将PBS缓慢加入到孔的边缘。
  注意：对于每个样本，一个井将用于绑定，另一个井将用于内部化。
  
  图1.实验板设置示例。用于结合和内化实验的板设置示例。胰蛋白酶阴性板是在结合后立即进行胰蛋白酶消化的阴性对照。
绑定（1孔）
1. 每孔加入200μlPBS。
2. 刮掉细胞并将其转移到1.7 ml的微量离心管中
3. 使用QIAGEN DNeasy血液和组织试剂盒分离总DNA，遵循制造商的说明书，但有以下例外：使用50μl分子级水从柱中洗脱样品。
  注意：为了提高DNA产量，可以在洗脱前将水加热至37℃，并将水置于膜上长达5分钟。
内化（1井）
1. 小心地将1ml新鲜的完全DMEM预热至37℃，通过将板倾斜向细胞，并用移液管非常缓慢地加入到孔的边缘。
2. 在组织培养箱中于37℃在5％CO 2中孵育1小时以允许病毒内化。
  注意：允许内部化的时间可以改变，或者可以测定几个时间点来产生内部曲线。
3. 通过抽吸取出培养基，并用1ml胰蛋白酶处理细胞，将其从板上分离出来，并除去未内化的表面结合的病毒粒子。
4. 将胰蛋白酶处理的细胞转移到1.7ml微量离心管中，并通过在室温下以500×g离心3-5分钟来沉淀细胞。
5. 仔细清除胰蛋白酶，不会干扰细胞沉淀
6. 通过将细胞重新悬浮在200μlPBS中3次洗涤细胞沉淀，通过离心500×g离心3-5分钟，并小心地除去PBS。
7. 最后PBS洗涤后，将细胞沉淀重悬于200μlPBS中
8. 使用QIAGEN DNeasy血液和组织试剂盒分离总DNA，遵循制造商的说明书，但有以下例外：使用50μl分子级水从柱中洗脱样品。
qPCR定量
1. 转基因（或选择的转基因）：
  1. 使用含有CBA-fLuc转基因的质粒产生载体基因组定量的标准曲线。
    1. 在分子级水中稀释10ng /μl质粒原液1：200，以产生5×10 4个/μg/μl的质粒溶液。
    2. 在分子级水中进行7次进一步的1:5的系列稀释，以产生标准曲线的其余部分，其中标准曲线的剩余点具有以下浓度：1×10 4/ff /μl， 2×10 3 /分钟fg /μl，4×10 2/ff /μl，8×10 fg /μl，1.6×10 ¹ fg /μl，3.2×10 ⁰ fg /μl和6.4×10 fg /μl。
      注意：如果qPCR板上有空格，应使用2个标准曲线使定量更准确。此外，这将允许在标准曲线内排除令人讨厌的点。
  2. 为n + 1反应准备主混合物（表1）（n为反应总数）。
    
    表1. qPCR主混合
    
    注意：为了制备F + R引物的工作原料，将F引物（20μM浓度）与R引物（20μM浓度）以1:1的比例混合。所得到的引物混合物将具有浓度为10μM的F和R引物。
  3. 在每个孔中加载8μl主混合物。
  4. 加载2μl每个样品，包括标准曲线。
    注意：将样品直接添加到孔的一侧可确保样品的完整载入。
  5. 在平板离心机中将板旋转30-60秒，以确保样品位于孔底部。
    注意：使用的VWR微孔板离心机的最大速度为500 x g。可调式微板离心机可用于500-600 x g。
  6. 使用表2中的相应程序运行qPCR。
    
    表2. qPCR循环参数
2. hLB2C1基因组基因

数据分析

要计算每个细胞的载体基因组数（表3），请使用以下计算：

通过取从标准曲线得到的绝对DNA值乘以1个质粒（270拷贝/fg，pTR-CBA-fLuc）中的单链质粒拷贝的数目来计算载体基因组拷贝数。 > 注意：该值使用以下公式计算，其中1e15等于一克中的飞镖数，650等于DNA碱基对的分子量。另外，由于AAV基因组是单链的，所以该值必须乘以2因子。
拷贝数= 2×（[6.022×10 ²³]/[质粒大小（bp×1×10 15）×650]）
通过从标准曲线得到的绝对DNA值除以每毫克DNA（167个基因组/ng）的人类二倍体基因组数目来计算二倍体基因组数目。
注意：每个二倍体人类基因组有约6 pg的基因组DNA。因此，在每个纳克基因组DNA中，有〜167个二倍体基因组。
通过将载体基因组的总数除以二倍体基因组的数目来计算每个二倍体基因组的载体基因组数量。
绑定数据表示为vg/cell（图2）。内部化也可以表示为vg/cell。或者，通过将内化的vg /细胞数除以结合的vg /细胞的数目，内化可以表示为结合的病毒粒子的百分比（图2）。

表3.样本数据分析

注意：这是使用Luc引物或hLB2C1引物的qPCR产生的绝对DNA值。

使用双尾学生的假设均衡性来确定 P - 值。另外：重要的是运行内化阴性对照（结合后立即胰蛋白酶化细胞）和正确的qPCR（纯水）阴性对照。此外，独立实验可以在相同的qPCR板上运行。

图2.使用VCP抑制剂Eeyarestatin I（EerI）处理的细胞的结合和内化数据的实例.EerI不改变AAV2与HeLa细胞的结合。 B.EerI不会显着改变AAV2的内在化。

食谱

10 ng /μlCBA-fLuc质粒原液
在398μl分子级水中的2μl质粒
100ng /μlHeLa基因组DNA储备液（1：2）
50μl分子级水中的50μl基因组DNA

致谢

本研究由国家卫生研究院R01HL089221和P01HL112761通过NHLBI支持。这项工作也得到了国家卫生研究院培训基金会通过NIGMS 5T32 GM007092的支持。本文描述的方案基于以下论文：Berry等人（2016）。

参考文献

Berry，GE和Asokan，A.（2016）。内吞分选的化学调节增强腺相关病毒转导。 J Biol Chem 291（2）：939-947。
Grieger，JC和Samulski，RJ（2012）。 Adeno 相关的病毒载体学，制造和临床应用。 方法Enzymol 507：229-254。