材料和试剂

无菌解剖刀刀片（Swan Morton，目录号：n°11和n°24）
灭菌移液器吸头
200微升（Thermo Fischer Scientific，Fischer Scientific，目录号：02-681-2）
1000μl（Thermo Fischer Scientific，Fischer Scientific，目录号：02-681-4）
无菌塑料环（Greiner Bio One，目录号：731171）
Falcon 15 ml锥形离心管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
软组织（OrapiHygiène，目录号：186）
一次性无菌剥离器/镊子 - 11.1厘米。（4¼in。）（TSIC解决方案，目录号：UTIL-1037）
90×15mm培养皿（Corning，Gosselin ^{TM，目录号：BP93B-15）}
1.5ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
1.5ml离心管一次性丸粒杵（Kimble Chase Life Science and Research Products，目录号：749521-1500）
甘蔗苗（品种CP68-1026易受甘蔗叶片烫伤）
野生型菌株和致突变体的突变体（Wilbrink培养基+适当的抗生素生长4至5天）;对于突变体的特征，参见Fleites等人（2013）和Mensi等人。（2016）
无菌蒸馏水
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
蔗糖（Merck Millipore，目录号：107687）
蛋白胨（BD，Bacto ^TM，目录号：211677）
磷酸氢钾，二元，三水合物（K 2/2 HPO 4·3H 2 O）（EMD Millipore，Calbiochem，目录号：529567） br />
七水硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（EMD Millipore，目录号：105886）
亚硫酸钠（Na 2 SO 3）（EMD Millipore，目录号：106657）
琼脂（BD，Bacto ^TM，目录号：214010）
溴化钾，KBr（Sigma-Aldrich，目录号：P0838）
Benomyl（Sigma-Aldrich，目录号：381586）
环己酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：C1988）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：32294）
注意：本产品已停产。
头孢氨苄（Sigma-Aldrich，目录号：C0675000）
新生霉素（Sigma-Aldrich，目录号：1475008）
春日霉素（Sigma-Aldrich，目录号：19408-46-9）
硝酸铵（NH 4 NO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：A3795）
硝酸钾（KNO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：P8291）
硝酸钙四水合物（Ca（NO 3 3）2·4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C2786）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
硼酸（H 3 O 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
硫酸锰（II）一水合物（MnSO 4·H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M7899）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z1001）
碘化钾（KI）（Sigma-Aldrich，目录号：P8166）
钼酸铵四氢化物（（NH 4））6 Mo 7 O 24·4H 2/> O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1019）
硝酸铜（II）三水合物（Cu（NO 3 3）2·3H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：61194） br />
硫酸铁（II）七水合物（FeSO 4·7H 2 O）（EMD Millipore，目录号：103965）
Na 2 EDTA·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：N4126）
吡哆醇盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P6280）
肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：I7508）
二氯化二硫化胺（Sigma-Aldrich，目录号：T1270）
Phytagel（Sigma-Aldrich，目录号：P8169）
Wilbrink介质（WM）（见配方）
Wilbrink选择性戴维斯（WSD）培养基（见食谱）
大量营养素（见食谱）
微量营养素（见食谱）
EDTA EDTA（参见食谱）
富士维生素（见食谱）
甘蔗苗生长营养培养基（见食谱）

设备

生长室
200 x 20毫米带盖的Pyrex试管（Legallais，目录号：761224）
200毫米长钝镊子（VWR，目录号：82027-436）
微量移液器
20-200μl（Eppendorf，目录号：3120000054）
100-1,000μl（Eppendorf，目录号：3120000062）
头盔（天鹅莫顿，目录号：N°3G S/S和N°4G S/S）
微生物培养箱（Memmert，型号：B40）
注意：本产品已停产。
台式涡旋（Scientific Industries，型号：Vortex Genie 2）
分光光度计（Eppendorf Biophotometer）
250或500ml宽颈锥形瓶（硼硅酸盐玻璃）（Duran，目录号：21 226 36或21 226 44）
层流柜或无菌罩
高压灭菌器

软件

软件包R，版本2.14.1（R开发核心团队）

程序

组织培养甘蔗苗的制备
1. 来自顶端组织的甘蔗品种CP68-1026的组织培养的小植株在28℃的培养室中传播并维持12小时光。
2. 在接种前四周，将年轻的二次分蘖转移到含有组织培养的小植株的营养培养基的新的200×20mm试管中，如下：
3. 将试管在28℃的生长室中孵育12小时光照四周
细菌接种物准备
1. 在植物接种前5天，连续染上每株X片段。使用灭菌叶片或移液管尖端的-80℃蒸馏水库进行试验，并用合适的抗生素（用于突变株）进行测试，并使培养物在28℃的培养箱中生长5天C。
2. 对于每个菌株，用15ml Falcon锥形离心管中的10ml无菌蒸馏水中的无菌聚丙烯环将琼脂平板上的细菌菌落悬浮（以获得混浊悬浮液）。用台式涡旋手动或轻轻地旋转细菌悬浮液，然后使用分光光度计测量其在600nm（OD 600）的光密度。
3. 为了制备原液悬浮液，用无菌蒸馏水调节细菌悬浮液，得到对应于10μL/ml菌落形成单位（CFU）/ml的OD 600/0.25-0.30 。
4. 为了在10μg/ml CFU/ml下制备接种物，将5ml以10μg/ml CFU/ml校准的5ml细菌悬浮液稀释在495ml无菌蒸馏水中的500ml锥形瓶。
甘蔗苗通过浸泡接种
1. 对于接种，使用2至4个完全展开的叶子的植物（图1）
  
  图1.在试管中展示三个完全膨胀的叶子的甘蔗苗
2. 使用无菌镊子将组织培养的小植株的叶子浸入调节至10μg/ml CFU/ml的细菌悬浮液中30-40秒（图2）。在浸入叶子期间，使锥形瓶的温和循环运动，以优化细菌悬浮液与甘蔗叶表面的接触。
  
  图2.在X中，甘蔗苗的叶子浸泡30-40秒。调节为10μg/ml的白蛋白悬浮液 CFU/ml
3. 浸泡后，通过将叶子拖过锥形瓶的壁边缘去除过量的细菌悬浮液：叶片表面上不应有可见的液滴。然后，将含有相同营养培养基的相同试管（使用无菌镊子）取代接种的小植株。
4. 将接种的小植株在28℃的生长室中保持12小时，持续14天。
5. 接种至少六个（用于叶印记测定，参见D.1）至15（对于叶洗涤和组织匀浆测定，参见D.2）每个X株菌株的甘蔗苗。并将它们随机分布在生长室中。
6. 用无菌蒸馏水接种对照小植物。
确定X。 albilineans 叶子附件
X附件的叶子。可以使用以下两种方法测定白蛋白：1，甘蔗叶在选择培养基上的印迹（半定量方法）和2.叶洗涤和组织匀浆（定量方法）。
1. 确定X的容量。叶片印记的叶子附着物
2. 确定X。通过叶子洗涤和组织匀浆，叶片附着物对于这种生物测定，每个菌株接种15个甘蔗小植株。在每个采样时间（1 h，7和14天），每个小植株分别使用5个小植株和2个叶来确定X的附着能力。 albilineans 。实验重复独立至少两次。进行叶洗以分离和定量位于叶表面的细菌，而进行叶匀浆以分离和定量来自保护区（如气孔室）或叶内的细菌。

数据分析

使用由Mensi等人（2016）描述的统计软件包R，版本2.14.1（R Development Core Team）分析数据。叶片附着（ELA）值的范围是每个实验中每个菌株或突变体的三个独立实验与六个重复（小植株）的手段的组合。请注意，每个小植物印有2到4个叶子。尽管植物之间的ELA手段之间可能存在显着差异，但所有数据均用于统计分析
为了通过叶子洗涤和叶匀浆测定叶子附着，数据来自20个叶子，并且从两个分别的5个小植株的实验组合（每个接种的甘蔗小植物采集两个叶子，在每个采样时间使用5个小植株）。在计算总体平均值之前，使用log10函数（y = log 10 /（CFU/ml）+ 1]）转化个体群体数据（CFU/ml）。适当时（少数数据），单独日志转换数据可用于方差分析的平均比较。
通过叶片印迹（半定量方法）和叶洗（数量方法）获得的数据相关，并产生与叶片表面上存在的细菌群体相关的相似信息。相比之下，通过叶匀浆获得的数据与不能容易地从叶表面分离并位于受保护的叶片区域或叶内的细菌相关联。推荐叶片印迹快速，方便地筛选细菌菌株的叶片附着能力。建议采用叶子清洗/均质化方式获得更精确和定量的数据，以及关于叶片上或叶中细菌定位的其他信息。

笔记

在层流柜（无菌条件）下进行细菌悬浮液制备，甘蔗浸种和叶面印迹。
用于接种甘蔗小植物的细菌悬浮液新鲜（刚好在接种程序之前）制备。细菌悬浮液仅用几个单个菌落制备，以获得所需的细菌浓度。使用的菌落数量将取决于菌落的大小。储存在冷藏库中的菌株在零下80摄氏度下分别从单个菌落中发出。
甘蔗叶仔细选择印刷或洗涤;我们只选择绿色和无枯叶。
使用具有10％叶面积增量的模板目视估计汇合生长的面积。
本文使用甘蔗品种CP68-2016，但也可以测试其他对甘蔗叶烫伤敏感的品种。
本文使用的细菌菌株未观察到非特异性粘附。但是，确定并包括不适应甘蔗的细菌种类作为阴性对照是一个好主意

食谱

Wilbrink介质（WM）（1升）
10g蔗糖
5克蛋白胨
0.50g K 2 2 HPO 4·3H 2 O
0.25g MgSO 4·7H 2 O→// 0.05g Na 2 SO 3
15克琼脂
加蒸馏水使1升
将pH调节至6.8-7.0
高压灭菌器在121°C 20分钟
Wilbrink选择性戴维斯（WSD）媒介（1L）
与WM培养基相同，但补充：
加热灭菌前5g KBr和0.004g Benomyl（杀真菌剂）高压灭菌后，加入：
将0.1g放线菌酮溶解于500μl乙醇中 0.025g头孢氨苄溶解于500μl无菌蒸馏水中 0.03g新生霉素溶于500μl乙醇中将0.05克春雷霉素溶于500微升无菌蒸馏水中
大量营养素（1升）
10g NH 4，否3
10 g KNO 3
5g Ca（NO 3）2< 2> 2< 2< 2> 715mg MgSO 4·7H 2 O→// 3g KH 2 PO 4
650毫克KCl
加入蒸馏水至1升
微量营养素（100毫升）
160mg H 3 BO 3//
1,400mg MnSO 4·H 2 O
380mg ZnSO 4·7H 2 O
75 mg KI
10 mg（NH 4）6 O 7 Mo 2 O 4·4H 2 O 2
35mg Cu（NO 3 3）2·3H 2 O
加入蒸馏水至100 ml
将溶液在-20℃下储存在1.5ml微量离心管中
三氯化铁
2.78g FeSO 4·7H 2 O 2/
3.73g Na 2 EDTA·2H 2 O 500毫升蒸馏水
分别溶解Na 2 EDTA和FeSO 4，并通过温和加热溶液将FeSO 4加入到Na 2 EDTA中
富士维生素
50毫克烟酸（沸水）
10mg吡哆醇盐酸盐
10克肌醇蛋白
10毫克二氯化二硫化胺（最后加入）
加入蒸馏水至100 ml
将溶液在-20℃下储存在1.5ml微量离心管中
用于甘蔗苗生长的营养培养基（1L）（改编自Chatenet ，2001）
100毫升大量营养素
1毫升微量营养素
5毫升三氯化铁EDTA 2毫升富士维生素
8克琼脂或4克Phytagel
40克蔗糖
890毫升蒸馏水
pH 5.8
在121°C高压灭菌20分钟

致谢

我们感谢Marie-JoséeDarroussat提供卓越的技术援助。 ImèneMensi得到了Cirad博士研究生的支持。这项工作得到美国农业部国家食品和农业研究所（项目Hatch/Rott FLA-BGL-005404）的支持。该协议是由Fleites等人（2013）和Mensi等人发表的工作改编而成。（2016）。

参考文献

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Chatenet，M.，Delage，C.，Ripolles，M.，Irey，M.，Lockhart，BEL and Rott，P。（2001）。通过顶端分生组织培养检测和生产无病毒甘蔗的甘蔗黄叶病毒 植物细胞 85（11）：1177-1180。
Fleet，LA，Mensi，I.，Gargani，D.，Zhang，S.，Rott，P.和Gabriel，DW（2013）。 Xanthomonas albilineans OmpA1似乎是功能模块化的，OMC和C样域都是叶片烫伤疾病所必需的甘蔗。分子植物微生物相互作用 26（10）：1200-1210。
Hirano，SS and Upper，CD（2000）。细菌在叶生态系统中，重点是

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Mensi，I.，Daugrois，JH，Pieretti，I.，Gargani，D.，Fleites，LA，Noell，J.，Bonnot，F.，Gabriel，DW and Rott，P。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25962850"target ="_ blank">表面多糖和群体感应涉及黄单胞菌属的附着和存活白皮书在甘蔗叶上。 Mol Plant Pathol 17（2）：236-246。
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