材料和试剂

转移移液管
15 ml Falcon管（Corning，Falcon ^®，目录号：352095）
96孔板，平底，聚苯乙烯，0.32厘米2，无菌。 TPP组织培养板（Sigma-Aldrich，目录号：Z707910）
聚苯乙烯TPP直径的组织培养皿。使用NGM（Sigma-Aldrich，目录号：Z707678）的60×15mm，表面积尺寸22.1cm 2
C。线虫 N2株
大肠杆菌OP50株
药物要屏蔽
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：795429）
次氯酸盐（NaClO）（Sigma-Aldrich，目录号：13440）
磷酸二氢钾（KH 2 O 3 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S5136）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O），BioUltra≥99.5％（KT）（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
磷酸氢二钾（K 2 O 3 HPO 4），ACS试剂，≥98％（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C3045）
乙醇（p.a.，无添加剂，≥99.8％）（Sigma-Aldrich，目录号：24102）
注意：本产品已停产。
柠檬酸一水合物（ACS试剂，≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：C1909）
柠檬酸三钾一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：6100-05-6）
EDTA二钠（98.5-101.5％，BioUltra）（Sigma-Aldrich，目录号：E1644）
硫酸铁（II）七水合物（FeSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：215422）
四氢化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：203734）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（BioReagent，适用于细胞培养）（Sigma-Aldrich，目录号：7446-20-0） >
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（BioReagent，适用于细胞培养，≥98％）（Sigma-Aldrich，目录号：C8027）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
溶解液（参见食谱）
M9缓冲液（1升）（见配方）
S中（1 L）（见配方）

设备

临床离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：22-029-416）
倒置显微镜（ZEISS，型号：Axio Vert.A1）
生化需氧量（BOD）培养箱（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ^TM，目录号：37-20）
Micropipet，100-1,000μl体积（Nichipet Eco移液器，目录号：Z710199）
高压灭菌器

程序

文化同步（改编自Stiernagle，2006）
1. 用含有近500个妊娠雌雄同体的 C.elegans 板开始手术。在板中加入5ml M9缓冲液，用移液管轻轻搅拌液体，以从琼脂中除去蠕虫。
2. 使用移液管将蠕虫转移到15ml无菌Falcon管中，以800 x g离心1分钟。蠕虫颗粒必须以3.5ml总体积悬浮。
3. 向管中加入1.5ml裂解溶液。轻轻摇动管子5分钟，手动观察，在显微镜下观察，检查蠕虫是否已经瓦解。大多数蠕虫体已经溶解，以800 x g离心1分钟。
4. 去除大部分裂解溶液，而不会干扰蛋颗粒。
5. 然后，将沉淀物悬浮在5ml的M9缓冲液中，离心1000×g 5分钟，除去上清液，加入新鲜的M9并重复这些步骤2次。
6. 所获得的卵可以以三种不同的程序并行进行我可以将蛋与药物在20℃下直接孵育15小时。
  II，可以将蛋在20℃孵育15小时以产生幼虫，最后可以用药物孵育24小时，以避免在晚期发育。
  III，蛋可以在20℃下孵育3天以产生成年人。成年人最多可以与药物一起孵育3天，以避免新生代。图1总结了文化同步和使用三个不同的生命阶段。线虫 - 胚胎卵，幼虫和成年人（步骤B，C和D）以评估药物的驱虫活性。
  
  图1.总结培养同步程序的方案，以及胚芽卵，幼虫和成年人（步骤B，C和D）的使用，以评估药物的驱虫活性强>
蛋孵卵测定
1. 在同步程序之后，用移液管将蛋转移到96孔板上。
2. 在200μlS培养基中每孔加入约30个鸡蛋。
3. 用倒置显微镜计数和鉴定鸡蛋内的胚胎阶段，观察幼虫发育。
  注意：在用药物处理之前，确定原始形式的存在对于确定初始模式是重要的，并且验证裂解溶液是否影响了卵。可以根据图2B识别原肠形式
4. 加入不同浓度的药物，并在BOD培养箱中于20℃孵育15小时。
5. 在孵化结束时，通过光学显微镜检测每种不同药物浓度的阴影和未孵化的蛋和L1幼虫的百分数。应进行六次独立实验的重复。
  
  图2.显示不同的C的相差光学显微镜图像。线虫阶段。 A.胚胎在第一次切割; ; ula形C.用逗号表示的胚胎D.里面有一只幼虫的鸡蛋（3倍的阶段表示完全的幼虫发育）; E. L1期;外阴（v）可以观察; G. Vulva（v）和许多鸡蛋（e）在更高的放大倍数; H.可以观察雌雄同体性腺（g）。
幼虫发育测定
1. 在同步程序之后，在温和的搅拌下将蛋放入含有S培养基和大肠杆菌的微管中，在20℃，BOD培养箱中放置15小时。
2. 此后，在第一阶段收集幼虫（L1/L2）（图2E）。或者，鸡蛋可以在没有食物的情况下孵化，因为发育将被逮捕，幼虫将保持为L1。
3. 在S培养基中将幼虫的浓度调整为20只幼虫/50μl。
4. 在含有补充有E的S培养基的96孔板中，在20℃下孵育24小时。大肠杆菌和不同浓度的待分析药物。应进行六次独立实验的重复。
使用成人的测定
1. 在同步程序之后，将卵转移到用Em种植的NGM（线虫生长培养基）板上。大肠杆菌用移液管。将蛋在BOD培养箱中在20℃下孵育3天以获得大部分同龄成虫线虫。
2. 通过用5ml M9洗涤NGM板收集成年蠕虫，以移除蠕虫，并在Falcon管中以800 x g离心5分钟。取出上清液，并在同一缓冲液（3次）中洗涤沉淀。
3. 在含有补充有E的S培养基的96孔板中每孔放置三十根线虫。大肠杆菌。细菌可以进行高压灭菌，以避免在孵育期间过度生长。我们建议约2×10 3细菌/ml。
4. 在研究中添加不同浓度的待筛选药物。在用作阴性对照的孔中必须省略药物。
5. 在BOD培养箱中在20℃下孵育3天。三天应该是最大的孵化期，以避免新一代的成年人的存在。
6. 在这一时期之后，通过光学显微镜计数生活和死亡蠕虫，通过视频1所示，考虑咽喉的运动性和瘫痪以及直体发生的总动员丧失。使用倒置显微镜做出这些观察。应进行六次独立实验的重复。
  
  <！ - flashid2113v159开始 - >
  视频1.通过相位对比光显微镜观察咽部球茎的运动性和瘫痪的动画，发生死亡蠕虫的直体
  
  <！ - flashid2113v159结束 - >

数据分析

为了评估成虫和幼虫的生存及其活力，活检蠕虫必须通过光学显微镜计数，不包括测定期间孵出的幼虫阶段。使用生殖器官的大小和存在作为遵循原始成年人口的标准（图2F-2H）。
在卵孵化测定中，应确定每种不同药物浓度的孵化和未孵化的卵的百分比和L1幼虫的存活率（如Sant'Anna等人，2016）。
Kaplan Meyer检验可用于分析治疗期间个体的生存情况，生存曲线应通过对数秩检验进行比较（Kaplan和Meier，1958）。

笔记

胆固醇的缺乏或低浓度影响胚胎的存活，因为它对卵母细胞的发育至关重要。 S培养基应含有足够的胆固醇（Greenstein，2005）。

食谱

溶解液
5 N NaOH
1％次氯酸盐
新鲜准备的每批批次
M9缓冲区（1 L）
3g KH 2 PO 4
6g Na 2 HPO 4
5克NaCl
0.25g MgSO 4·7H 2 O→// 高压灭菌和储存在4°C
S中（1升）
1. S基础
  5.85克NaCl
  1 g K 2 HPO 4
  6g KH 2 PO 4
  1毫升胆固醇（5毫克/毫升乙醇）
2. 10ml 1M柠檬酸钾，pH 6
  20克柠檬酸一水合物
  293.5g柠檬酸三钾一水合物
  将H ₂ O添加到1 L
  通过高压灭菌消毒
3. 10ml痕量金属溶液
  1.86g EDTA二钠盐 0.69g FeSO 4·7H 2 O -/
  0.2g MnCl 2·4H 2 O
  0.29g ZnSO 4·7H 2 O
  0.025g CuSO 4·5H 2 O
  将H ₂ O添加到1 L
  通过高压灭菌消毒，保护免受光照
4. 3ml 1M CaCl 2
5. 3ml 1M MgSO 4
注意：在无菌条件下操作组分;不要对整个介质进行高压灭菌。所有的食谱都是从Stiernagle（2006）改编而成。

致谢

作者感谢Caenorhabditis遗传中心捐赠了C。 elegans 野生型和巴西机构：FundaçãodeCoordinatorçãodeaperfeiçoamentode Pessoal deNívelSuperior-CAPES，Conselho Nacional de DesenvolvimentoCientíficoeTecnológico-CNPq和FundaçãoCarlos Chagas Filho de AmparoàPesquisa do Estado do Rio de Janeiro -FAPERJ支持这项工作。

参考文献

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Kaplan，EL和Meier，P.（1958）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/01621459.1958.10501452"target ="_ blank ">来自不完整观察结果的非参数估计。美国统计学家协会53（282）：457-481。
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Sant'Anna，V.，de Souza，W.和Vommaro，RC（2016）。除草二硝基苯胺对线虫模型秀丽隐杆线虫的启示效应 167 Parasitol 167：43-49。
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