材料和试剂

透析管
MWCO 8 kDa（Carl Roth，目录号：1924.1）
MWCO 3.5kDa（Carl Roth，目录号：E860.1）
集中者
MWCO 50 kDa（EMD Millipore，目录号：UFC905024）
MWCO 3 kDa（EMD Millipore，目录号：UFC800324）
结晶板（HAMPTON RESEARCH，目录号：HR3-158）
波特管和活塞（VWR，目录号：432-0205和432-0211）
50ml管
E。大肠杆菌MC1061（Coli Genetic Stock Center，目录号：6649）
质粒pBXNPHM3-Nb5776（图1A）
注意：该质粒含有在araBAD启动子控制下编码纳米体的基因，并导致与N末端pelB前导序列融合的纳米体的产生，随后是decaHis标签，MBP和HRV 3C蛋白酶现场。它含有β-内酰胺抗生素标记。质粒可根据要求提供非商业用途。
质粒pBXC3GH-SLC26Dg（图1B）
注意：该质粒将编码SLC26Dg的基因保持在araBAD启动子的控制下，并导致与C端HRV 3C蛋白酶位点，GFP和decaHis标签融合的SLC26Dg的产生。它含有β-内酰胺抗生素标记。质粒可根据要求提供非商业用途。

图1.质粒图。 A。 pBXNPHM3-Nb5776质粒图; B. pBXC3GH-SLC26Dg的质粒图。指出了质粒的独特的限制性位点和重要特征
氨苄青霉素钠盐（Carl Roth，目录号：K029.2）
L-阿拉伯糖（ddH 2 O中为20％w/v）（Carl Roth，目录号：5118.2）
1 M KPi，pH 7.5（见配方）
K 2（HPO 4）（AppliChem，目录号：121512）
KH ₂ PO <4>（AppliChem，目录号：131509）
氯化钠（NaCl，2.5M，ddH 2 O）（Carl Roth，目录号：3957.1）
溶菌酶（ddH 2 O中为100mg/ml）（AppliChem，目录号：A3711）
DNAse I（ddH 2 O中为2mg/ml）（AppliChem，目录号：A3778）
硫酸镁七水合物（MgSO 4，1M，ddH 2 O）（Carl Roth，目录号：P027.2）
苯基甲基磺酰氟（PMSF，乙醇中200mM）（Carl Roth，目录号：6367.1）
NiNTA（50％w/v浆液在20％EtOH中）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：88223）}
ddH ₂ O
咪唑（2M，pH7.5，HCl，ddH2O）（Carl Roth，目录号：X998.4）
HEPES（1M，pH7.5，NaOH，ddH 2 O）（Carl Roth，目录号：HN78.2）
HRV 3C蛋白酶（自制）
聚丙二醇2000（ddH 2 O中为10％v/v）（Sigma-Aldrich，目录号：81380-1L）
EDTA，二钠盐水合物（Carl Roth，目录号：X986.1）
甘油，86％（w/v）（Carl Roth，目录号：4043.3）
液氮
癸基麦芽糖苷（ddH 2 O中为10％w/v）（Anatrace，目录号：D322S和D322LA）
甲酸铵（Carl Roth，目录号：5093.1）
醋酸钠（醋酸钠）（Carl Roth，目录号：6773.2）
PEG400（Sigma-Aldrich，目录号：91893）
Trypton（AppliChem，目录号：A1553）
酵母提取物（AppliChem，目录号：A1552）
琼脂（应用，目录号：A0917）
LB琼脂（参见食谱）
TB培养基（参见食谱）
水库解决方案（见配方）

设备

5 L挡板烧瓶
孵化器在37°C
可调温度的振动筛（Infors，型号：HT Multitron）
离心机用于造粒培养（Thermo Fisher科学，Thermo科学，型号：Thermo Sorvall Evolution RC）
均质器（IKA，型号：ULTRA-TURRAX T25）
高压细胞破坏器（Avestin，型号：Emulsiflex C3）
Nanodrop（Thermo Fisher Scientific，Nanodrop ^{TM，型号：1000，停产）}
磁力搅拌器（Heidolph Instruments，型号：Hei-Mix S）
SEC栏Superdex 75 10/300 GL（GE Healthcare，目录号：17-5174-01）
SEC列Superdex 200 10/300 GL（GE Healthcare，目录号：28-9909-44）
台式离心机（VWR，型号：Micro Star 17）
HPLC（GE Healthcare，型号：ÄKTAprimeplus）
发酵罐（BIOENGiNEERiNG，型号：NLF22，30L）
分光光度计（Amersham Biosciences，型号：Ultrospec 10）
注意：本产品已停产。
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima XPN-100K Ultracentrifuge）

程序

生产和净化Nb5776
1. 变换E。大肠杆菌MC1061与pBXNPHM3-Nb5776。在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上培养。在37°C过夜生长。
2. 挑取单个菌落以接种补充有100μg/ml氨苄青霉素（TB/Amp）的20ml TB培养基的预培养物。在37°C过夜生长。
3. 在5L挡板烧瓶中接种1.5L TB/Amp，15ml预培养物，并在37℃下培养。调节振动速度以确保足够的通气，同时避免泡沫形成（〜100 rpm）。
4. 1.5小时后，将培养箱的温度设定在25℃，使培养物在1小时内冷却。诱导0.01％L-阿拉伯糖的终浓度，一旦OD 600在0.5-1.0之间。继续孵育过夜（〜16 h）。
5. 通过在4℃下以5,500×g离心15分钟收获细胞。从这里保持样品冷却（0-4°C）和预冷解决方案和设备预先。
6. 将细胞重悬于冰冷的50mM KPi，pH7.5,150mM NaCl中至最终OD 600 = 150-200。
7. 加入溶菌酶（最终1mg/ml），DNAse I（20μg/ml终浓度）和MgSO 4（最终浓度为1mM）。
8. 使用Ultra-Turrax T25匀浆器使细胞均质化，例如。
9. 在搅拌下，在4℃下孵育约60分钟。
10. 使用高压细胞破坏器（Emulsiflex，预冷）以10 kPsi通过三次通过破坏细胞。
11. 加入PMSF至最终浓度为1 mM。
12. 在4℃以140,000×g离心裂解物30分钟。
13. 准备NiNTA柱。使用3毫升固体NiNTA。用〜10柱体积（CV; 30ml）ddH 2 O和约10℃（30ml）的50mM KPi，pH7.5,150mM NaCl洗涤柱。
14. 将上清液从步骤A12转移到新容器中，并用咪唑补充至终浓度为15mM
15. 在4℃下，用NiNTA孵育上清1小时，旋转
16. 排水柱。
17. 用20 CV（60ml）20mM HEPES，pH7.5,500mM NaCl，50mM咪唑洗涤柱
18. 具有5×0.5CV（1.5ml）20mM HEPES，pH7.5,150mM NaCl，300mM咪唑的洗脱柱。
19. 使用Nanodrop确定蛋白质浓度
20. 池峰分数并加入3C蛋白酶至最终蛋白质：HRV 3C蛋白酶摩尔比为5：1。
21. 在4℃下消化过夜，同时对20mM HEPES，pH 7.5,150mM NaCl透析。在透析缓冲液中使用搅拌棒。透析管的MWCO应为3.5 kDa。透析体积应足以在完全平衡后获得15mM的最终咪唑浓度
22. 用2.5 CV 10mM HEPES，pH 7.5,150mM NaCl平衡大小排阻色谱柱（Superdex 75 10/300 GL）。
23. 使用1ml固体NiNTA（如步骤A13中与ddH 2 O和透析缓冲液一起预洗）在4℃旋转10分钟，使透析的材料转动。
24. 收集浓缩器（3 kDa MWCO）中的流通。浓缩器应用ddH 2 O运行，并用透析缓冲液冲洗。用3 CV透析缓冲液洗涤NiNTA色谱柱，并在浓缩器中收集该物质。
25. 离心浓缩器，在约3000℃10分钟，4℃。取出并反转几次以使溶液均质化（或者：上下移动）。重复，直至达到所需体积（<0.5 ml）
26. 将样品转移到预冷的1.5 ml杯中。在4℃的台式离心机中以16,000 x g离心10分钟。
27. 将上清液转移到新的预冷杯中
28. 准备HPLC。将新的管放在馏分收集器中。将注射器分开，用透析缓冲液冲洗。通过快速推出液体从注射器中清除气泡。预先冲洗针头和循环与透析缓冲液。
29. 将样品注入循环。开始运行一旦峰值接近，将分馏体积改为0.3毫升。峰值变化至1.4ml分馏后
30. 根据色谱图确定哪些馏分含有峰。使用Nanodrop确定这些级分中的蛋白质浓度。
31. 池峰分数和浓缩物（3kDa MWCO）至最终浓度超过10mg/ml。
32. 将样品储存在4°C直至使用。 Nb5776保持稳定至少3个月。
生产和净化SLC26Dg
1. 变换E。大肠杆菌MC1061与pBXC3GH_SLC26Dg。在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上培养。在37°C过夜生长。
2. 挑一个殖民地接种100 ml TB/Amp的预培养。在37°C过夜生长。
3. 在发酵罐中接种90升预培养的9L TB/Amp，并在37℃下培养。调节搅拌和曝气以保证快速增长。将容器压力调节至大约1巴超压，以减少发泡，并且如果形成泡沫，则用10％（v/v）聚丙二醇2000的小等分试样补充培养物。继续培养直到达到约2的OD 600。
4. 在1小时内逐渐将温度降至25°C。另外20分钟后，用2.5ml 20％（w/v）L-阿拉伯糖诱导培养。继续孵化一夜。
5. 通过在4℃下以5,500×g离心15分钟收获细胞。从这里保持样品冷却（0-4°C）和预冷解决方案和设备预先。
6. 将细胞重悬于50mM KPi，pH 7.5,150mM NaCl中，至600nm至150-200。
7. 加入溶菌酶（最终1mg/ml），DNAse I（20μg/ml终浓度）和MgSO 4（最终浓度为1mM）。
8. 使用Ultra-Turrax T25匀浆器使细胞均质化，例如。
9. 在搅拌下，在4℃下孵育约60分钟。
10. 使用高压细胞破坏器（Emulsiflex，预冷）以10 kPsi的三次通过破坏细胞。
11. 加入PMSF（1mM终浓度）和EDTA（5mM终浓度）
12. 进行低速旋转离心以除去未破裂的细胞，在4℃下以10,000×g/min进行15分钟。
13. 将上清液转移到适合超速离心的管道上
14. 进行高速旋转离心以使膜沉淀，1小时，16,000 x g，4℃。
15. 确定泡囊的净重。
16. 使用Potter管将囊泡重悬于50mM KPi，pH7.5,150mM NaCl，10％甘油中〜1g/2ml。
17. 以1/5/10 g等份的液氮冷冻囊泡。
18. 将等分试样储存在-80°C直到使用。 1年以上可以储存囊泡
19. 在室温水和搅拌棒的烧杯中解冻5g膜泡。解冻后，将样品放在冰上。
20. 将癸基麦芽糖（粉末级）粉末平衡至室温
21. 将粘稠的囊泡悬浮液转移到50ml管中。用冰冷的50mM KPi，pH7.5,150mM NaCl，10％甘油洗涤管，并将体积调节至40ml。
22. 加入咪唑至最终浓度为15 mM
23. 加入0.625g癸基麦芽糖苷，得到约1.6％的终浓度。保持泡沫：洗涤剂比例约为5g：0.5-0.6g是很重要的，以获得良好的增溶作用。
24. 在4℃下孵育1小时，旋转。
25. 在4℃下以160,000×g离心该材料30分钟。
26. 准备NiNTA柱。使用3毫升固体NiNTA。用〜10 CV（30 ml）ddH 2 O和约10 CV（30 ml）50 mM KPi，pH 7.5,150 mM NaCl，10％甘油洗涤柱。
27. 在4℃下，用NiNTA孵育上清1小时，旋转
28. 排水柱。
29. 用20 CV（60ml）20mM HEPES，pH7.5,150mM NaCl，10％甘油，50mM咪唑，0.2％癸基麦芽糖苷洗涤柱。
30. 洗脱柱，其中0.5份（1.5ml）20mM HEPES，pH7.5,150mM NaCl，10％甘油，300mM咪唑，0.2％癸基麦芽糖苷等分试样。
31. 使用Nanodrop确定蛋白质浓度
32. 池峰分数，并加入3C蛋白酶至最终蛋白质：3C蛋白酶摩尔比为5：1。
33. 在4℃下消化2小时，同时对20mM HEPES，pH 7.5,150mM NaCl，10％甘油，0.13％癸基麦芽糖苷透析。在透析缓冲液中使用搅拌棒。透析管的MWCO应为8 kDa。透析体积应足以在完全平衡后获得15mM的最终咪唑浓度
34. 用2.5 CV 10mM HEPES，pH 7.5,150mM NaCl，0.2％癸基麦芽糖苷（最高纯度）平衡大小排阻色谱柱（Superdex 200 10/300 GL）。
35. 使用0.6ml固体NiNTA（如步骤B26）在透析缓冲液中预先洗涤并在4℃下旋转10分钟，使透析的材料孵育。
36. 在浓缩器（50kDa MWCO）中收集流通。浓缩器应用ddH 2 O运行，并用透析缓冲液冲洗。用3 CV透析缓冲液洗涤NiNTA色谱柱，并在浓缩器中收集此流量。
37. 离心浓缩器，在3,000 x g，4℃下10分钟。取出并反转几次以使溶液均质化（或者：上下移动）。重复，直至达到所需体积（<0.5 ml）
38. 将样品转移到预冷的1.5 ml杯中。离心10分钟，在4°C的台式离心机中，16,000 x g
39. 将上清液转移到新的预冷杯中
40. 准备HPLC。将新的管放在馏分收集器中。将注射器分开，用透析缓冲液冲洗。通过快速推出液体从注射器中清除气泡。预先冲洗针头和循环与透析缓冲液。
41. 将样品注入循环。开始运行一旦峰值接近，将分馏体积改为0.3毫升。峰值变化至1.4ml分馏后
42. 根据色谱图确定哪些馏分含有峰。使用Nanodrop确定这些级分中的蛋白质浓度。
43. 池峰分数和浓缩物（50kDa MWCO）至最终浓度超过10mg/ml。
44. 不要存放样品，但立即进行复杂的形成和结晶。
SLC26Dg-Nb5776的络合物形成和结晶
1. 补充纯化和浓缩的具有癸基麦芽糖苷（10％w/v原料）的Nb5776至0.2％（w/v）的最终浓度。
2. 以1:2的摩尔比混合纯化的SLC26Dg和Nb5776。在4°C孵育10分钟。
3. 使用用10mM HEPES，pH 7.5,150mM NaCl，0.2％癸基麦芽糖平衡平衡的Superdex 200 10/300GL柱将样品提交给SEC。
4. 根据色谱图确定哪些馏分含有峰。使用Nanodrop确定这些级分中的蛋白质浓度。通过SDS-PAGE验证级分中两种蛋白质的存在。
5. 池峰分数和浓缩物（50kDa MWCO）至最终浓度约9-12mg/ml。
6. 在4℃下通过蒸气扩散在座滴中生长SLC26Dg-Nb5776晶体（1μl蛋白质+1μl储存溶液[参见食谱]）。以1:1的比例混合蛋白质和储层溶液。约1周后出现晶体。

数据分析

代表性数据如图2和3所示

图2.纯化SLC26Dg。根据本文详述的方案，在SLC26Dg纯化期间在不同步骤获得的样品的SDS-PAGE分析。 "洗脱"，"消化"和"SEC"是指在用HRV 3C蛋白酶消化后和从SEC柱洗脱后，从NiNTA柱洗脱后得到的样品。黑色和白色箭头分别表示含有GFP（与SLC26Dg或单独融合）和SLC26Dg的条带。右图是通过测量凝胶GFP荧光获得的SDS-PAGE凝胶的图像。左图是相同凝胶的考马斯染色图像。左侧显示分子量标记（kDa）。

图3. SLC26Dg和Nb5776的复合物形成A.如方案所示，用过量的Nb5776预温育的SLC26Dg的大小排阻色谱图。 B.来自SEC柱的相关峰分数的SDS-PAGE分析。 C.SLC26Dg-Nb5776复合物的蛋白质晶体。

食谱

LB琼脂（1升）
10 g try pton pton。。。 5克酵母提取物
5克NaCl
15克琼脂
将软化的H 2 O 2加入1L，并在121℃下高压灭菌20分钟
TB培养基（1升）

12 g try pton pton。。。。 24克酵母提取物
8.6 ml 86％（w/v）甘油将软化的H 2 O 2加入到950ml以上
50毫升1.44 MK 2 HPO 4，在ddH 2中的0.34M KH 2 PO 4 sub> O
分别对两种溶液进行高压灭菌（121℃，20分钟），并在使用前混合使用

1 M KPi，pH 7.5（200 ml）
制备200ml 1KH 2 HPO 4的溶液和100ml 1M KH 2 PO 4的溶液。 >使用ddH ₂ O
将两种溶液以约4:1的比例混合（K 2 HPO 4：KH 2 PO 4）在恒定搅拌的同时测量pH值
通过使用碱性（K ₂ HPO 4）或酸性（KH 2 PO 4）调节pH值，组件
水库解决方案
1M甲酸铵，50mM乙酸钠，pH4.5
45-50％PEG400（w/v）

致谢

这里详述的协议是在苏黎世大学Raimund Dutzler教授的实验室开发的，受益于Drs的有用建议。 Sandra Markovic，Ricarda J.C. Hilf，Ines Ehrnstorfer，Stefan Warmuth，Iwan Zimmermann和Markus Seeger教授。来自Vrije Universiteit Brussel的Jan Steyaert教授和Els Pardon博士被公认为生产和选择Nb5776。苏黎世大学蛋白质结晶中心的Beat Blattman和CélineStutz-Ducommun表示支持SLC26Dg/Nb5776建立结晶条件。尔格。承认人类边疆科学计划（LT-00899/2008）和德国研究基金会通过法兰克福高分子复合物卓越团队的长期奖学金的支持。

参考文献

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