材料和试剂

24孔透明平底TC处理的多孔细胞培养板（Corning，Falcon ^{®，目录号：353047）}
圆形玻璃盖玻片，Fisherbrand ^TM覆盖玻璃，直径（公制）12mm（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-545-80）
O型圈，PYREX ^{®克隆圆筒（10×10mm）（Corning，目录号：3166-10）}
基质细胞，前列腺成纤维细胞（WPMY-1）（ATCC，目录号：CRL-2854 ^TM）
前列腺癌PC-3细胞（ATCC，目录号：CRL-1435 ^TM）
胰蛋白酶/EDTA 0.25％（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4，不含钙，镁和酚红
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM）
一抗

抗胶原I（Calbiochem I-8H5，San Diego，CA和Sigma COL1，Sigma-Aldrich，目录号：C2456）
抗胶原IV，抗α1型IV（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-29010）
抗胶原V（EMD Millipore，目录号：AB763P和Abcam，目录号：ab134800）
兔抗纤维蛋白调节蛋白H-50（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-33772）
兔抗双低聚糖H-150（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-33788）
小鼠抗纤连蛋白（BD，BD Transduction Laboratories ^{TM，目录号：610077）}
山羊抗perlecan L-20（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-27449）
Anti-versican H-56（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-25831）
与Cy3缀合的小鼠抗平滑肌α肌动蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：克隆1A4）

（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes/Invitrogen，Eugene，OR）的
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11965092）}
L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10378016）}
多聚甲醛（水溶液：16％）（电子显微镜科学，目录号：15700）
完成培养基（见食谱）
4％多聚甲醛（见食谱）

设备

超细镊子用直的尖端（灭菌）（精细科学工具，目录号：11399-80）
CO 2细胞培养培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：51026280）}
台式离心机（Eppendorf，型号：5702RH）
自动细胞计数器或血细胞计数器
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：51026639）
注意：细胞培养实验必须在无菌条件下进行。
倒置荧光显微镜（Zeiss，型号：Observer.Z1 with Apotome）

软件

Prism-GraphPad软件

程序

准备O型圈共培养系统
1. 根据供应商的指导原则，成纤维细胞和前列腺癌细胞应保持分开的细胞系。
  注意：我们在DMEM完全培养基中维持PC3细胞和成纤维细胞。细胞以80-90％融合传代，并以300×g离心。//em>
2. 对于异型共培养系统，用胰蛋白酶/EDTA从培养皿中除去成纤维细胞和前列腺癌细胞，并离心。
3. 将细胞沉淀悬浮于完全培养基中
4. 将无菌O型圈放置在24孔聚苯乙烯培养皿中的玻璃盖玻片的顶部。
  注意：不要使用硅胶将O形圈固定到盖玻片上，因为它会影响细胞在无细胞区域的迁移。 O型圈只是坐在盖子上;因此，在将微孔板运送到培养箱中时应小心。
5. 将成纤维细胞（350μl中的1.5×10 4个）放置在O形环周围，并将前列腺癌细胞（0.5×10 4）在100μl中放置）环，如图1所示。
  注意：步骤A1至A7必须在生物安全柜内进行，以确保文化不育和操作人员的安全。
  
  图1. O型圈共培养技术将成纤维细胞接种在O型圈周围，将癌细胞接种在O型圈内。
6. 将细胞在37℃和5％CO 2维持与O形环培养24小时。
7. 然后用钳子去除O形环，并用完全培养基洗涤细胞两次以除去任何未附着的细胞，然后在37℃和5％CO 2下再培养48小时注意：在移除O型圈后，研究人员可以确定O型圈面积是无细胞的，这表明细胞系之间没有交叉污染。在接下来的24小时内，两条细胞系容易迁移到无细胞区域，形成一个包含两个直接接触的细胞系的区域。
8. 对于免疫细胞化学，在24或48小时后，将细胞固定在PBS中制备的4％多聚甲醛中注意：研究人员应在显微镜下监测其细胞，以确定固定其特定细胞类型的最佳时间。我们确定24小时是大多数细胞类型的最佳选择。
ECM分子的免疫荧光染色
1. 细胞用PBS洗涤，并在封闭溶液（5％FBS）中在室温下孵育1小时
2. 然后将细胞与一抗在4℃孵育过夜。我们发表的工作中使用的主要抗体是：抗胶原I（Calbiochem I-8H5和Sigma COL1），抗胶原IV（抗α1型IV）和两种不同的抗胶原V（Chemicon AB763P和Abcam克隆V-3 C9），兔抗纤维蛋白调节蛋白（Santa Cruz H-50），兔抗三聚糖（Santa Cruz H-150），小鼠抗纤维连接蛋白，山羊抗perlecan（Santa Cruz L-20），anti-versican（Santa Cruz H-56），最后，与Cy3缀合的小鼠抗平滑肌α肌动蛋白（克隆1A4）
3. 然后将盖玻片洗涤三次15分钟，并在室温下用与Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594缀合的合适的荧光二抗孵育1小时。 br />
4. 然后将盖玻片用PBS洗涤三次，每次洗涤15分钟，并在Fluoromount G（PBS中的2:1）中载玻片上。
5. 必须对免疫染色实验进行阴性对照。这些在我们的一组实验中完成，省略了一级抗体。使用扫描共焦倒置显微镜（Zeiss LSM510）检查盖片，并使用LSM图像浏览器进行荧光定量。

数据分析

此方法以前用于分析前列腺和结肠直肠基质反应（Coulson-Thomas等，2010和2011）。在这些研究中，仅在成纤维细胞区域，仅含有癌细胞的区域和界面中分析细胞外基质（ECM）产生，其中包含成纤维细胞和癌细胞。包含成纤维细胞和癌细胞的界面可以在图2中看到。通过免疫细胞化学分析ECM，使用针对不同ECM组分的一系列抗体。我们重复实验至少三次，一式三份，产生统计学显着的结果，使用Prism-GraphPad软件的Student's 测试。

图2.包含前列腺癌细胞和成纤维细胞的O形环区域的图像。成纤维细胞通过绿色波形蛋白染色证明，前列腺癌细胞用红色微管蛋白染色证实。刻度棒=20μm。

笔记

该方案被开发用于研究基质细胞和肿瘤细胞之间的间作;然而，它可以与任何两种单元格类型一起使用。
这种共培养技术是一种有趣的平台，用于测试抗肿瘤药物对激活的成纤维细胞微环境内的肿瘤细胞，活化的成纤维细胞和肿瘤细胞的影响，其更接近生理环境。
根据其增殖情况，使用不同的细胞系时，应适应在O型圈内和O型圈周围种植的细胞数。
O型圈和盖玻片在使用前进行高压灭菌。

食谱

完成培养基
DMEM
胎牛血清（FBS）（终浓度：10％）
L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素（1x）
4％多聚甲醛
多聚甲醛（最终浓度：4％）
PBS

致谢

该协议来自Coulson-Thomas等人。（2010）。这项工作由FAPESP，CAPES和CNPq资助。

参考文献

Coulson-Thomas，VJ，Coulson-Thomas，YM，Gesteira，TF，de Paula，CA，Mader，AM，Waisberg，J.，Pinhal，MA，Friedl，A.，Toma，L.and Nader，HB（2011）。结肠直肠癌发育不良反应上调胶原合成和限制癌细胞侵袭。细胞组织研究 346（2）：223-236。
Coulson-Thomas，VJ，Coulson-Thomas，YM，Gesteira，TF，Andrade de Paula，CA，Carneiro，CR，Ortiz，V.，Toma，L.，Kao，WW和Nader，HB（2013）一个class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23399832"target ="_ blank">前列腺癌的Lumican表达，定位和抗肿瘤活性。 Exp Cell Res 319（7）：967-981。
Coulson-Thomas，VJ，Gesteira，TF，Coulson-Thomas，YM，Vicente，CM，Tersariol，IL，Nader，HB and Toma，L。（2010）。< a class ="ke-insertfile"href = http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20727350"target ="_ blank">成纤维细胞和前列腺肿瘤细胞的串扰：成纤维细胞分化，TGF-β和细胞外基质下调。 > Exp Cell Res 316（19）：3207-3226。
Coulson-Thomas，YM，Gesteira，TF，Norton，AL，Kao，WW，Nader，HB and Coulson-Thomas，VJ（2015）。