材料和试剂

手套
组织幻灯片
超级霜加幻灯片
盖帽
LNA ^TM Scramble-miR探针（Exiqon，目录号：699004-370）
LNA ^TM miR-409-3p 5'生物素标记（Exiqon，目录号：610701-370）
LNA ^TM标记的miR-409-5p 5'生物素（Exiqon，目录号：615615-370）
RNaseZap（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM）
二甲苯
乙醇
无菌PBS（pH 7）
指甲油
马血清（Vector Laboratories，目录号：S-2000）
链霉亲和素嵌段试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM）
链霉亲和素偶联的QD 625nm（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：A10196）（来自Invitrogen的1μm存货）}
链霉亲和素缀合的QD 565nm（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：Q10131MP）（来自Invitrogen的1μm存货）}
6％无IgG，无蛋白酶BSA（Jackson ImmunoResearch，目录号：001-000-162）
BSA
0.4％Triton X-100
0.1％Tween-20
安装媒体
4'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Vector Laboratories）
1M Tris-HCl（pH7.4）
0.5 M EDTA
NaCl
无RNase的Milli-Q水，高压灭菌（在该水中制备的所有溶液）
Exiqon microRNA ISH缓冲液组和蛋白酶K（Exiqon，目录号：90000）
20x SSC，pH 7.0
蛋白酶K库存（见食谱）
蛋白酶K缓冲液（参见食谱）
蛋白酶K溶液（15μg/ml）（参见食谱）
SSC解决方案（见配方）
杂交组合（见配方）
链霉亲和素阻断溶液（参见食谱）
QD解决方案（见配方）
PBS-T（见食谱）

设备

高压灭菌器
混合器（DAKO Statspin Hybridizer）
玻璃切割机
滑架和玻璃瓶
PAP笔或ImmEdge笔（Vector Laboratories，目录号：H-4000）
水浴
CRi多光谱摄像机，内置Nuance软件和InForm软件（PerkinElmer，Waltham，MA）

软件

Nuance v3.1软件
通知v1.3软件
Graphpad Prism软件

程序

注意：

原位杂交程序已在Exiqon ISH协议中详细描述。
注意RNA工作

所有步骤都应该在干净，无核酸的环境中进行。
所有表面均应用RNaseZap清洁。
请始终佩戴手套，并使用高压灭菌的玻璃器皿和RNase级MilliQ水进行高压灭菌以制备所有溶液。
如Exiqon手册中所述进行原位杂交。

优化

在实际测定开始之前需要优化蛋白酶K处理。蛋白酶K试剂在使用前立即以15μg/ml的浓度制备。
LNA miRNA探针和加扰miRNA的优化。 80nM的探针浓度对于检测miR-409-3p和miR-409-5p是最佳的

在实验当天准备的试剂

蛋白酶K
杂交混合物：将适量的探针置于2ml不粘核糖核酸酶管中。探头在90℃变形4分钟。离心管并旋转下来。加入2毫升1x miRNA ISH缓冲液

在二甲苯和乙醇中脱蜡
1. 二甲苯5分钟，玻璃瓶中3次
2. 99.9％乙醇 - 10分钟，2次，在玻璃瓶中
3. 99.9％乙醇 - 5分钟，1次，在玻璃瓶中
4. 96％乙醇-10分钟，1次，在玻璃瓶中
5. 96％乙醇 - 5分钟，1次，在玻璃瓶中
6. 70％乙醇 - 10分钟，1次，在玻璃瓶子里
7. 70％乙醇 - 5分钟，1次，在玻璃瓶子里
8. PBS - 2-5分钟，每次1次，在玻璃瓶中
蛋白酶K处理和洗涤
1. 将蛋白酶K加入蛋白酶K缓冲液（终浓度15μg/ml）（加入7.5μl蛋白酶K储存液至10ml蛋白酶K缓冲液）。
2. 加入足够体积的蛋白酶K溶液以覆盖幻灯片（Exiqon手册中的说明）。
3. 孵化10分钟，在37℃，在杂交器中。
4. 将载玻片转移到含有PBS的新玻璃瓶中。重复此步骤。
杂交
1. 使用PAP笔在组织部分周围标记。
2. 使用玻璃切割机切割盖玻片（高压灭菌）至肿瘤组织切片的大小。
3. 在组织切片上加入miRNA检测探针（50μl，杂交混合物）。避免气泡。
4. 如果载玻片具有相同肿瘤的几个连续组织切片，则可用于确定几个探针（如miR-409-3p，miR-409-5p和Scramble miRNA）。一旦添加探头，请非常小心地放置切割的盖玻片，而不会吸入气泡。
5. 使用无色指甲油将盖玻片的边缘密封到幻灯片。让它干
6. 将幻灯片放置在55℃的Hybridizer中1小时。
拆卸和清洗
1. 小心地取出盖玻片。
2. 将载玻片放入带有5x SSC的玻璃瓶中，在55°C的水浴中注意：使用55°C的水浴在玻璃瓶中进行洗涤。用高压灭菌水制备分级SSC溶液。
3. 5x SSC - 5分55℃
4. 1x SSC - 5分55℃
5. 1x SSC - 5分55℃
6. 0.2x SSC - 5分55℃
7. 0.2x SSC - 5分55℃
8. 0.2x SSC - 5分钟RT
9. 在PBS中孵育幻灯片。
阻止
将载玻片在含有2.5％马血清和20％链霉亲和素阻滞剂的PBS中在室温下孵育1小时。
单一QD标签
1. 在含有6％无IgG的无蛋白酶BSA的PBS-T中以10nM共振制备链霉亲和素偶联的量子点（565nm [绿色]和625nm [红色]）。
2. 将载玻片在37℃下孵育60分钟
洗涤
将载玻片在PBS-T（PBS + 0.4％Triton X-100 + 0.1％Tween-20）中洗涤3次，每次5分钟。
安装
用含有4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的水性载体介质用盖玻片覆盖载玻片。
图像采集
使用CRi光谱成像系统。使用Nuance v3.1软件拍摄多光谱图像。对于组织的每个区域，以450nm至800nm的间隔以10nm的间隔拍摄串行图像。这产生一个立方体，具有不同波长的36个不同图像的堆叠，并且具有图像中每个像素的光谱信息。以400倍放大倍率获取图像（图2）。

图2.使用原位检测的Gleason等级8的人类前列腺癌组织样品上miR-409-3p（绿色）和miR-409-5p（红色）的多路复用图像的代表性图像，杂交和量子点标记。 DAPI染色为蓝色。加扰miRNA用作阴性对照，在相同组织的单独载玻片上的相邻区段上。苏木精和曙红染色（H& E）也得到了证实。（放大40倍）

数据分析

一旦执行了数据采集，图像被去卷积或不混合，以通过指定的QD提取特定信号。为565和625 nm建立了一个光谱库。使用光谱库来混合立方体。使用Real Component Analysis插件软件降低自动荧光。解混后的图像表示组织上QD的分布。使用Inform v1.3软件量化信号。该软件区分癌症和基质（非癌症）区域。该软件还基于DAPI染色来区分核和细胞质区域。使用该软件可以确定和定量来自肿瘤和基质切片的QD信号。产生图像的数值，肿瘤的细胞质成分和基质区用于绘制数据。数据使用Graphpad Prism软件进行图形化绘制。数据分布以箱形图形式进行了描述。使用非参数Wilcoxon秩和检验进行组织阵列的统计分析。 P 的值0.05被认为具有统计学意义。

笔记

多路复用QD

原理：多重ISH-QD标记涉及使用ISH标记的miRNA-生物素探针的单个组织，随后进行链霉抗生物素蛋白封闭步骤，并与链霉抗生物素蛋白缀合的QD一起温育。该过程与另一种miRNA-生物素探针和另一种（不同波长）的链霉亲和素偶联的QD对重复。最后，组织用含有DAPI的载体介质染色。因此，在单个组织切片上生成具有不同活性荧光QD的不同miRNA的图像
程序：顺序染色幻灯片，用一个miRNA探针和QD程序，然后是另一个探针和QD。在第一次QD标记后，将载玻片用PBS-T洗涤3次，每次5分钟。然后将幻灯片用于与另一种miRNA探针杂交（方法C），并继续进行步骤H.杂交混合物和探针稳定仅6个月，避免多次冻融循环。

新鲜制备的组织载玻片提供更好的miRNA信号。较老的组织制剂，由于RNase随时间的退化而可能会损失miRNA含量

食谱

蛋白酶K库存
在600μl10 mM Tris-HCl，pH 7.4（不含RNase）中重构20 mg/ml。储存于-20°C
蛋白酶K缓冲液
5ml 1M Tris-HCl（pH7.4）
2 ml 0.5 M EDTA 0.2 ml 5 M NaCl 900毫升无RNase的水
调节体积至1000毫升，高压釜
蛋白酶K溶液（15μg/ml）
在实验开始之前，将7.5μl蛋白酶K储备液添加到10ml蛋白酶K缓冲液中以使浓度为15μg/ml
SSC解决方案
库存：20x SSC解决方案
5×SSC：1L = 250ml 20×SSC + 750ml水 5×SSC：1L = 50ml 20×SSC + 950ml水
5×SSC：1L = 10ml 20×SSC + 990ml水
所有解决方案要高压灭菌
杂交组合（miRNA ISH缓冲液和LNA ^{TM检测探针）
注意：LNA ^TM miRNA检测探针的浓度为25μM，浓度为40μl。}

将1ml 2x ISH缓冲液加入1ml无RNase的水中
在加入ISH缓冲液之前，在90℃下将LNA ^TM miRNA检测探针变性4分钟。旋转解决方案
为了制备80 nM的miRNA探针，加入6.4μl变性探针（25μM）至2 ml的1x ISH缓冲液，注意：杂交组合可以在-20°C储存六个月。

链霉亲和素阻断溶液
含有2.5％马血清和20％链霉抗生物素蛋白阻断剂的PBS/PBS
QD解决方案
在具有6％IgG，无蛋白酶BSA的PBS中以10nM共振制备链霉亲和素偶合的量子点（565nm [绿色]和625nm [红色]），
PBS-T（PBS + 0.4％Triton X-100 + 0.1％吐温-20）
加入1ml吐温-20和4ml Triton X-100至1μLPBS 高压灭菌在121°C 15分钟

Achnowledgments

该程序已部分公布于Hu等人，2011年和Josson等人，2015年。原位杂交程序已从Exiqon ISH协议进行优化。这项工作的授权来自P01-CA98912，DAMD-17-03-02-0033，RO1-CA122602（L.W.K. Chung）。

参考文献

Hu，P.，Chu，GC，Zhu，G.，Yang，H.，Luthringer，D.，Prins，G.，Habib，F.，Wang，Y.，Wang，R.，Chung，LW和Zhau， HE（2011）。激活的c的多重量子点标签 - 在去势抗性人类前列腺癌中的信号传导。 6（12）：e28670。
Josson，S.，Gururajan，M.，Sung，SY，Hu，P.，Shao，C.，Zhau，HE，Liu，C.，Lichterman，J.，Duan，P.，Li，Q.，Rogatko， A.，Posadas，EM，Haga，CL和Chung，LW（2015）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25065597"基质成纤维细胞衍生的miR-409促进上皮 - 间质转化和前列腺肿瘤发生。 34（21）：2690-2699。