材料和试剂

盖玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：3323）
4×40mm双层条
石蜡膜（Bemis，目录号：PM996）
显微镜幻灯片（帆牌，目录号：7105）
毛细管纸
俄勒冈州绿色（OG）标记的肌动蛋白（Scott等人，2011）
重组AtFormin5和植物AtProfilin5（Liu等人，2015）
N-乙基马来酰亚胺 - 肌球蛋白（Amann和Pollard，2001）
未标记的兔肌肉肌动蛋白（Kuhn和Pollard，2005）
EGTA（AMRESCO，目录号：0732）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2393）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
咪唑（EMD Millipore，目录号：814223）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T3253）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A6559）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
叠氮化钠（NaN 3 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
EDTA（AMRESCO，目录号：0322）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
来自牛肝的过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9322）
来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich，目录号：G7141）
甲基纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：M0262）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A1933）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
10x KMEI（见配方）
10x ME（见配方）
缓冲液G（见配方）
1x TIRFM缓冲区（见配方）
HS-TBS（见配方）
HS-BSA（参见食谱）
LS-BSA（参见食谱）

设备

酒精燃烧器
-80°C冰箱
离心机
分光光度计作为Infinite 200 PRO多模式阅读器（Tecan Trading）的附件
配备倒置TIRF照明系统的Olympus IX81显微镜（Olympus，型号：IX81），具有100x油TIRF物镜（1.49数值孔径）
氩激光（488nm激发）
光度级联II 512 CCD相机（Photometrics，型号：Photometrics cascade II 512 CCD相机）

软件

MicroManager软件（ https://micro-manager.org/）
ImageJ软件（ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ;版本1.41）

程序

制备TIRFM流通池

将两个4 x 40毫米的Parafilm双层条带紧紧地装在24 x 60毫米的盖玻璃上，留下3-4毫米的间隙。
将25 x 76 mm的显微镜载玻片垂直放在盖玻片上，制成流通池。轻轻按。
将酒精燃烧器中的流动池加热2-3秒，以确保石蜡膜紧密地粘到玻璃盖和显微镜载玻片上。腔体积应约为40μl
参见图1，了解如何制作流通池。

图1.用于制作TIRFM流动池的卡通

肌动蛋白单体的制备

将100μlOG标记的肌动蛋白（约20μM）从-80℃冰箱中取出并在冰水中解冻。然后在4℃下将其在200,000xg下离心2小时。随后，离心后小心吸出50μl上清液，并保存在黑暗的冰上（见注1）
使用缓冲液G作为对照，将10μl微升上清液稀释至490μl缓冲液G中以测定肌动蛋白浓度。因为不是所有的肌动蛋白单体都被标记，未标记或标记的肌动蛋白的浓度是通过与Infinite 200 PRO多模式阅读器相关联的分光光度计测定的。为了确定总肌动蛋白的浓度，在290nm和491nm处使用在290nm处的激光系数为26,600M cm ^-1的肌动蛋白和对于俄勒冈州绿，分别在491nm处为77,800M ^-1 cm ^{-1，并且使用以下等式计算总肌动蛋白的浓度：[总肌动蛋白] =（ 290 <！ - SIPO - >为0.16991×A 491 ×50×10 -6 /26,600μM。}
通常，一个肌动蛋白单体由Cys-374上的一个俄克隆 - 绿色分子标记（Kuhn和Pollard，2005），因此我们可以通过计算俄勒冈州 - 绿色分子的浓度来推断标记肌动蛋白的浓度。使用以下等式计算OG的浓度：[OG] = A 491 /77,800μM。所以[OG]被用作[OG-肌动蛋白]。通常OG-肌动蛋白的浓度约为5μM，未标记的肌动蛋白为1〜2μM。

将OG肌动蛋白与未标记的肌动蛋白以等摩尔比混合，随后将1/10体积的10x ME加入到溶液中并保持在黑暗的冰上。
在HS-TBS中将NEM-肌球蛋白稀释至20nM，将40μl稀释的NEM-肌球蛋白注射到室中，在室温下在黑暗中孵育5分钟。
流动池用40μlHS-BSA洗涤，然后立即用40μlLS-BSA洗涤，并在室温下在黑暗中孵育2分钟。一小部分毛细管纸通过毛细作用放置在腔室的另一侧，以帮助流体流出。
流动池用40μl1x TIRFM缓冲液洗涤。
将1×TIRFM缓冲液中的肌动蛋白单体（0.75μM，50％OG标记）注入室中。通过TIRF照明在装有100x油物镜的Olympus IX81显微镜下观察到单肌动蛋白丝的生长，并以2或3秒的间隔用MicroManager成像软件（Micro Manager）捕获图像。 OG被488nm氩激光激发，并且使用Photometrics cascade II 512 CCD摄像机拍摄延时系列图像并保存为tiff文件。该文件可以打开并通过ImageJ软件进一步分析。
例子

实施例1.Fin5（FH5）消除Profilin5（PRF5）对自发性肌动蛋白成核的抑制作用。将各种浓度的蛋白质在肌动蛋白单体中在暗中预孵育5分钟，然后注入流动池。请参见图2中的示例
实施例2.测定PRF4和PRF5对肌动蛋白丝长度的影响。

步骤1.将1xTIRFM缓冲液中的0.75μM的肌动蛋白单体注入腔室。在肌动蛋白组装反应运行约10分钟后，它将产生足够量的肌动蛋白长丝端以允许在步骤2（步骤8b.ii）中的细丝伸长。通过TIRF照明在Olympus IX81显微镜下观察肌动蛋白丝。图像采集顺序采集程序，在10分钟后暂停。最后一帧和时间点被标记为进一步分析。
步骤2.在步骤1（步骤8b.i）中的1xTIRFM缓冲液中，将等量的肌动蛋白单体在步骤1（步骤8b.i）中的存在或不存在下，在暗处快速且温和地与肌动蛋白预温育5分钟，按顺序保持幻灯片的位置。通常，注射可以在一分钟内完成。然后重新开始顺序采集程序，以继续图像采集另外10分钟。 PRF-肌动蛋白复合物将添加到现有长丝的末端以促进进一步伸长。图像系列保存为tiff文件。分析图像序列时，应考虑两个观察点之间的时间间隔。参见图3中的示例。

数据分析

保存的延时图像系列在ImageJ软件中打开，比例尺设置为6像素为1μm。图2显示为肌动蛋白成核事件的可视化和定量的实例。基本上，通过在不同时间点计数每个微观场的肌动蛋白丝数（>1μm）并绘制（图2）来比较成核活性。与普林林作为肌动蛋白单体螯合蛋白的生化活性一致，PRF5抑制自发聚合;而FH5可以通过利用PRF5-肌动蛋白复合物加速肌动蛋白聚合，克服PRF5对自发肌动蛋白聚合的抑制作用。

图2.单个肌动蛋白丝的成核的直接可视化A.具有或不具有各种ABP的自发肌动蛋白组装的延时图像。 [肌动蛋白]，0.75μM; [PRF5]，1.5μM; [AtFH5]，0.9μM。 Bar =10μm。另请参见补充视频1- 3 。 B.在肌动蛋白组装过程中每个微观场的肌动蛋白丝数量的图。值表示平均值±SD，n = 3
图3示出了在肌动蛋白丝的倒刺末端和尖端两端计算长丝伸长率的实例。单个肌动蛋白丝在其末端的伸长率通过ImageJ软件中的MultipleKymograph工具计算。为了计算肌动蛋白丝的伸长率，最初画出沿着延时电影中覆盖两端的长丝的生长路径的细线，随后产生Kymograph。前缘的斜率表示生长速率（μm/sec）。通过假设每μm细丝有330个亚单位（Kuhn和Pollard，2005），两端的生长速率（亚单位/秒）随后计算为亚单位/秒。如图3所示，两个profilins都减慢了单个肌动蛋白长丝在有倒钩端的伸长率，而PRF4和PRF5对长丝伸长率的影响没有明显的差异。

图3.直接显示单个肌动蛋白丝的伸长率。 A.在存在或不存在profilins（PRF）的情况下自发肌动蛋白组装的延时图像。蓝色箭头表示在存在或不存在PRF的情况下添加肌动蛋白单体的时间点。 [肌动蛋白]，0.75μM; [PRF4]，0.75μM; [PRF5]，0.75μM。 B.在不存在（a）或存在profilins（b，c）的情况下单丝生长的Kymograph分析。绿色和红色箭头分别表示有倒钩的末端和尖端。标记为左侧与时间（x轴，500秒）的细丝的长度（y轴）的扫描图。 Bar =5μm。另请参见补充视频4- 6 。 C.两端长丝生长速率的统计。每次分析使用超过十根单丝。值表示平均值±SD。

笔记

离心后，移出OG-肌动蛋白的上清液（见步骤2a）后，DO请仔细从表面层吸出液体，不要将移液管深入管中，因为底物的肌动蛋白单体缺乏活力。
1x TIRFM缓冲液非常粘稠，所以在使用前请彻底混合组分（参见食谱）。
每3小时更换一次新鲜的TIRFM缓冲液，以保持减少的环境。保持荧光分子的亮度（俄勒冈州绿色）非常重要。
高激光功率或长时间暴露会导致肌动蛋白丝断裂。激光功率不应太高，通常10-20％对于50mW的激光器是可行的。曝光时间也不要太长，300-600毫秒就可以了（参见步骤7）。

食谱

10倍KMEI
10 mM EGTA
10mM MgCl 2
500 mM KCl
100mM咪唑，pH 7.0
10x ME
10 mM EGTA
1mM MgCl 2
缓冲区G
5mM Tris-HCl，pH8.0
0.2mM CaCl 2
0.2 mM ATP
0.2 mM DTT
0.02％NaN 3
1x TIRFM缓冲区
10mM咪唑，pH 7.0
50 mM KCl
1mM MgCl 2
1 mM EGTA
50 mM DTT
0.2 mM ATP
50mM CaCl 2
15 mM葡萄糖
20μg/ml过氧化氢酶
100μg/ml葡萄糖氧化酶
0.5％甲基纤维素
HS-TBS
50mM Tris-HCl，pH7.5
600 mM NaCl
HS-BSA
50mM Tris-HCl，pH7.5
600 mM NaCl
1％BSA
LS-BSA
50mM Tris-HCl，pH7.5
150 mM NaCl
1％BSA

致谢

该协议是从我们之前发表的作品（Yang等人，2011; Liu等人，2015）中改编而来的。我们感谢黄实验室的前成员为优化方案所做的努力，以及芝加哥大学医学博士David Kovar先生就开始运行该试验的建议。黄实验室的研究得到了中国科技部（2013CB945100）和国家自然科学基金（31671390和31471266）的资助。

参考文献

Amann，KJ和Pollard，TD（2001）。 Direct使用全内反射荧光显微镜实时观察由Arp2/3复合物介导的肌动蛋白丝分支。 Proc Natl Acad Sci USA 98（26）：15009-15013。
Kuhn，JR和Pollard，TD（2005）。 Real通过全内反射荧光显微镜对肌动蛋白丝聚合的时间测量。生物相似物88（2）：1387-1402。
Liu，X.，Qu，X.，Jiang，Y.，Chang，M.，Zhang，R.，Wu，Y.，Fu，Y.and Huang，S。（2015）。< a class = profilin调节顶端肌动蛋白聚合以控制极性花粉管生长。莫尔工厂 8（12）：1694-1709。
Scott，BJ，Neidt，EM和Kovar，DR（2011）。分子生物细胞22（20）：3826-3839。
Yang，W.，Ren，S.，Zhang，X.，Gao，M.，Ye，S.，Qi，Y.，Zheng，Y.，Wang，J.，Zeng，L.，Li， Huang，S.和He，Z.（2011）。< a class =" ke-insertfile"href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21307285"> BENT UPPERMOST INTERNODE1编码对肌动蛋白组织和水稻发育至关重要的II类formin FH5。植物细胞 23（2）：661-680。