材料和试剂

1.5ml微量离心管（VWR，目录号：20170-650）
离心管，聚丙烯，无菌，50ml（Corning，Falcon ^{®，目录号：352070）}
微量移液器（Mettler-Toledo，Rainin，目录号：KitPR-START）
培养皿，100 x 15毫米（VWR，目录号：25384-088）
塑料袋
方形比色皿，10 mm路径长度（Thermo Fisher Scientific，目录号：331709）
巴斯德移液器（VWR，目录号：14673-010）
细菌培养物（可在-80℃下保持在25％甘油中）
冠心病（Sigma-Aldrich，目录号：C8115）
甘油（VWR，BDH ^{，目录号：BDH1172-1LP）}
无菌蒸馏超纯水
三氟乙酸（TFA）（Sigma-Aldrich，目录号：302031）
乙腈（Sigma-Aldrich，目录号：34998）
利福平
3 N HCl（VWR，BDH ^{®，目录号：BDH7375-1）}
乙酸乙酯（VWR，BDH ，目录号：BDH1123-4LG）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：S318-1）
BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：23225）}
Tryptone（IBI Scientific，目录号：41116105）
酵母提取物（U.S.Biotech Sources，BTS，目录号：Y01PD-500）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-500）
细菌琼脂（IBI Scientific，目录号：IB49171）
氯化铵（NH 4 Cl）（VWR，目录号：470300-196）
七水硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（VWR，目录号：97062-134）
磷酸钾（KH 2 PO 4）（VWR，目录号：97062-350）
磷酸氢二钾三水合物（K 2 HPO 4·3H 2 O）（VWR，目录号：ALFA33365.A1）
硝酸钾（KNO 3）（VWR，目录号：97065-038）
氯化铁（III）（FeCl 3）（VWR，目录号：470301-584）
葡萄糖（VWR，目录号：101094-092）
低钠Luria Bertani培养基（见食谱）
液体HSC介质（见配方）

设备

HPLC系统：配有四元泵，自动进样器，恒温柱室和二极管阵列的Agilent 1200 HPLC（Agilent Technologies，型号：Agilent 1200 HPLC）
C8柱，4.6×250mm，5μm（ASTEC，Whippany，NJ，USA或等同物）
Shaker孵化器（Eppendorf，型号：New Brunswick ^TM Innova ^® 42R）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，型号：Spectronic 20D +）
微量离心机（Eppendorf，型号：5418）
水浴（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Precision GP 2S）}
涡旋（VWR，目录号：945300）
高压釜（VWR，目录号：97002-402）
层流罩（ESCO，型号：AC1-4E8）
离心机（Eppendorf，型号：5810）
协同净水系统（EMD Millipore，目录号：SYNS0HFWW）

软件

色谱数据系统软件（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）
Microsoft Excel

程序

校准曲线
1. 必须使用纯化的COR产生校准曲线，以确定生物样品中COR的精确浓度。在1.5ml微量离心管中制备不同浓度（5-50μg/ml）的五种COR溶液;使得5μl的溶液代表在25-250ng之间的COR量的范围。使用C8柱（4.6×250mm，5μm）通过HPLC在208nm检测到COR。使用流速为1ml/min的0.05％TFA:乙腈（60:40v/v）流动相进行等度分离。柱温度设定在25℃。将5μl等分的纯化的COR注入HPLC C8柱。纯冠心病必须在9.4分钟内产生峰值
2. 使用色谱数据系统软件，将每个浓度的COR峰值下的面积进行整合。绘制如图1所示的冠状面积相对于冠状动脉注射的ng图。计算使用线性回归分析获得的趋势线的线性方程。
  
  图1.5-50μg/ml冠心病（COR）的标准曲线纯化的COR注入不同浓度，每次注射的峰面积（以任意单位）用色谱数据系统软件。请注意，每个数据点的红色错误栏非常小，图形中不会清楚地显示。
确定COR的细菌生产
1. 从甘油储备液中，在补充有适当抗生素的低盐Luria Bertani（LS-LB）培养基上条件培养细菌，并将培养基板在28℃下孵育约30小时。例如，使用100μg/ml的利福平来培养产生COR的Pseudomonas syringae pv。西蒙 DC3000。
2. 将一小部分单一菌落（只是与尖端接触）从这个新鲜的板中接种到10ml具有合适的抗生素的10ml LS-LB培养基中，并在28℃和200rpm下孵育。生长直至达到中期至晚期对数期（OD 600）为0.8）。大约需要10-12小时。使用分光光度计检查600 nm处的光密度（OD）。
3. 将细菌悬液以2,600×g离心在50ml管中20分钟。取出上清液，并将颗粒重新悬浮在10ml无菌水中。彻底冲洗漩涡细胞。以全速连续旋转，直到细胞完全重新悬浮，没有可见的细胞团。重复此步骤两次。最后，将总细菌细胞重新悬浮在40ml无菌水中，得到对应于1×10 8个细胞的0.2 OD 600接种物，用于 pv。番茄。 OD 600的计算的近似是足够的。
4. 从50ml培养瓶中将1ml转移到10ml的HSC培养基中，并在18℃和200rpm下孵育24小时。如果需要更大浓度的COR，可以使用更多的培养体积。然而，1毫升足以进行COR检测。从10ml细菌培养物中，可以得到0.5-2μg/mg总蛋白质的COR浓度。
5. 24小时后，将0.6ml培养物转移到微量离心管中。在室温下以微量离心机旋转最大速度（或16,000×g g）3分钟以沉淀细胞。
6. 将0.5ml上清液转移到新鲜的离心管中，并将沉淀的细胞储存在-80℃。这些细胞用于估计总蛋白质含量，如下文步骤B14所述。
7. 向上清液中加入25μl3N HCl和0.5ml乙酸乙酯。以最大速度短暂旋转管30秒。允许阶段分离。这两个阶段应在两分钟内分开。
8. 将0.4ml乙酸乙酯相（上层）转移到新鲜的离心管中。
9. 重复步骤B7-B8两次（图2）。
  
  图2. COR提取流程图使用乙酸乙酯从细菌培养上清液中提取COR的步骤。将三个乙酸乙酯相在单个管中混合并干燥。将干燥的COR溶解在TFA：乙腈中，此溶液现在可以注入HPLC。
10. 在压缩空气流下干管内容物。一种方法是使用巴斯德吸管轻轻地将空气吹入每个管中（参见图3中的代表性设置）在55°C水浴中漂浮管。或者，管可以在室温下在室温下放置过夜。
  
  图3.设置用于在水浴中干燥微量离心管的内容物。在用乙酸乙酯从细菌培养物中提取COR后，通过将管悬浮在设定为55的水浴上来蒸发乙酸乙酯°C，并使用巴斯德吸管吹气。或者，管可以保持开放一整夜。
11. 对于HPLC分析，向每个干燥管中加入250μl的0.05％TFA：乙腈（90:10v/v）。涡旋每管15秒。样品现在可以直接注入HPLC系统。
12. 通过HPLC测定COR的存在，使用C8色谱柱（4.6×250mm，5μm），在208nm检测。使用流速为1ml/min的0.05％TFA:乙腈（60:40v/v）流动相进行等度分离。注射体积为5μl，柱温设定在25℃。
13. 将未知样品注入HPLC系统。如果在9.4分钟观测到峰值，则确定峰值下的面积。使用峰面积，应用标准曲线和线性方程来确定5μl注射的冠状动脉的摄取。然后，计算样品的μg/ml coronatine
14. 产生的COR的量可以表示为蛋白质浓度的函数。将步骤B6中获得的细胞通过将沉淀悬浮在1ml 1N NaOH中，然后沸腾和冷冻三次来裂解。根据制造商的说明书，用Pierce BCA蛋白测定试剂盒测定细菌细胞裂解物中的总蛋白质含量。表达如Panchal等人（2016）所示的COR浓度为μg/mg蛋白质。

数据分析

产生COR的细菌丁香草 pv。必须使用番茄株DC3000及其衍生的COR缺陷型突变菌株DC3118或DB29作为本试验的阳性和阴性对照。
应使用至少三项技术重复和三项生物重复进行定量的COR。统计分析应通过计算复制品中COR生产的平均值和标准误差来进行。通过执行学生的测试可以获得两个样本之间的差异的显着性。这些分析和线性回归可以用Microsoft Excel或其他可比较的统计分析软件完成。

笔记

始终使用从甘油原液新鲜划分的细菌病原体分离物。分离物的多次培养可能导致毒力和COR生产的丧失。理想情况下，每两年从植物宿主中分离细菌病原体。
需要在HSC培养基中培养至少24小时才能连续生产COR。

食谱

低钠Luria Bertani培养基
10g/L胰蛋白胨
5克/升酵母提取物
5克/升NaCl
2.5％琼脂
用NaOH调节pH至7.0 高压灭菌介质在15psi，120℃下15分钟。让培养基冷却至约55℃，并根据需要加入适当的抗生素。将介质在层流罩中倒入板中。在4°C的塑料袋中放置板，以避免中度脱水
液体HSC培养基
A部分：
1.0g NH 4 Cl
0.2g MgSO 4·7H 2 O→// 4.1g KH 2 PO 4
3.6g K 2 HPO 4 <3h 2=""> O
0.3g KNO 3
10ml 2mM FeCl 3
890毫升ddH 2 O -/- 将pH调节至6.8
高压灭菌10 psi，120°C 20分钟
B部分：
20 g葡萄糖 100ml ddH 2 O 过滤灭菌溶液
将零件A和B分开存放在4°C。在使用前将A部分和B部分（9：1比例）混合使用

致谢

我们感谢Carol Bender博士关于冠状动脉提取方法的有用建议。这项研究得到了美国国家过敏和传染病研究所（5R01AI068718）给Maeli Melotto医生的资助。

参考文献

Palmer，DA和Bender，CL（1993）。效果的环保和营养因素通过丁香假单胞菌生产聚酮化合物植物毒素冠状病毒。 Appl Environ Microbiol 59（5）：1619-1626。
Panchal，S.，Roy，D.，Chitrakar，R.，Price，L.，Breitbach，ZS，Armstrong，DW和Melotto，M。（2016）。 Coronatine促进了晚期的拟南芥叶片的感染丁香假单胞菌。/a> 前植物科学 7：880.