材料和试剂

个人防护装备（PPE;处理浓酸和碱时应始终佩戴），见注1）

安全眼镜
实验室外套
手套

移液器提示
移液器套件
冰桶
2毫升Sarstedt管（SARSTEDT，目录号：72.694.007）
选择植物材料或细胞壁制备
液氮
丙酮≥99.5％（EMD Millipore，目录号：AX0120）
Lugol碘染色溶液（Sigma-Aldrich，目录号：32922）
1.5N氢氧化钠（NaOH，强碱）≥97％（Fisher Scientific，目录号：BP359-500）
0.5M盐酸羟胺（强还原剂;储存在Drierite容器中，在水中新鲜），98％（Sigma-Aldrich，目录号：255580）
氯仿，≥99.5％（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
甲醇≥99.8％（Fisher Scientific，目录号：A412P）
去离子水
乙醇，100％，200证明（Decon Labs，目录号：V1001）
乙酰溴（强酸，与水剧烈反应;在乙酸中稀释），99％（Sigma-Aldrich，目录号：135968）
冰醋酸≥99.7％（EMD Millipore，目录号：AX0073）
DMSO（二甲基亚砜），≥99.9％（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
氯仿 - 甲醇混合物（参见食谱）
70％乙醇（见食谱）
25％乙酰溴（见配方）
90％DMSO（参见食谱）

设备

80°C冷冻机
Wiley Mini-Mill（Thomas Scientific，目录号：3383L10）
低温兼容容器
CryoMill球磨机以及各种规格的钢球，研磨罐，安全阀和自动填充（Retsch，目录号：20.749.0001; 02.480.0002）
能够以10,000 x g（例如，Eppendorf，目录号：5424）旋转的微量离心机
化学罩
平台摇杆（VWR，目录号：12620-906）
10毫升玻璃量筒（Kimble Chase生命科学研究产品，目录号：20024D-10）
NanoDrop 2000C分光光度计，或其他UV-Vis（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，型号：ND-2000C-PC）
石英比色皿，0.7ml体积（Sigma-Aldrich，目录号：Z600199）
移液器
能够达到70℃的水浴或孵化器（例如，VWR，目录号：89032-216）
分析天平（Mettler Toledo，卓越系列）
涡街搅拌机（VWR，目录号：58816-123）
组织式冷冻干燥机（4.5升冷冻干燥冷冻干燥机）（Labconco，目录号：7750020）
带PTFE衬里的固体盖15毫米，用于7毫升玻璃螺旋瓶小瓶（Sigma-Aldrich，目录号：27152）
可选：玻璃珠（Kimble Chase Life Science and Research Products，catalog number：13500-4）
可选：Reacti-Therm加热和搅拌模块（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：TS-18823）

程序

植物材料制备（收集组织后2-4 d）
1. 收获大约5g（鲜重）所需的组织用于木质素含量测定后，在液氮中闪蒸冷冻，并在-80℃下储存至少1小时直到使用。
2. 冻干组织直到完全干燥;冷冻干燥的持续时间通常取决于组织密度，但通常需要至少24小时和高达72小时才能完全干燥。
3. 使用Wiley Mini-Mill研磨冷冻干燥的组织以通过60目筛网。 Wiley Mini-Mills装备了从长而薄的拟南芥茎（几毫米厚）到较厚的木质组织（〜1厘米）的干燥样品。
4. 将粗磨样品转移到具有钢球的低温相容容器中（将空间中的空间的1/3留在空气中），并使用Retsch CryoMill球磨机在5Hz下预冷却冷冻设定约3分钟，然后通过在30Hz下5-10分钟研磨。如果样品在初始研磨后不是均匀的细粉末，则应进行另一轮低温研磨。获得具有高表面积的细粉末是有必要的，以促进AIR中存在的木质素的完全消化（图1）。该组织将用于制备不溶于醇的残留物（AIR）。
  
  图1.表示不足够充分地干燥植物材料
酒精不溶性残留物（AIR）制剂（需2-3 d）
1. 将大约70毫克精细磨碎的组织称重到2毫升Sarstedt管中（见注2）。
2. 加入1.5 ml的70％乙醇，充分涡旋，≥10,000×g离心10分钟以沉淀残留物，尽可能多地除去上清液，而不会干扰沉淀物。
3. 用1.5ml 1:1氯仿：甲醇洗涤，涡旋重悬沉淀，然后如上一步骤所述离心并除去上清液。
4. 加入1.5ml丙酮，旋转，然后如前所述离心并除去上清液。将悬浮在残留丙酮中的材料在化学品罩中空气干燥，取出管帽，或在35℃的Reacti-Therm装置下在空气流下干燥直到完全干燥（见注3）。剩余的材料是AIR。
5. 为了去除空气，向沉淀物中加入1.5ml 90％DMSO，彻底涡旋，并以最高角度以至少50rpm的速度在平台摇臂上摇动过夜以促进混合。第二天，如前所述离心分离上清液（见附注4）。
6. 在1.5ml 90％DMSO中洗涤一次，旋转，离心，如上所述除去上清液。
7. 在1.5ml 70％乙醇中洗涤6次;旋转，然后如前所述每次离心并除去上清液。
8. 加入1.5ml丙酮，旋转，然后如前所述离心并除去上清液。将悬浮在残留丙酮中的材料在化学品罩中空气干燥过夜，或在35℃的空气流下在Reacti-Therm装置上干燥（见注3）。剩余的材料是去淀粉的AIR。
9. 通过用Lugol碘溶液染色一小部分去淀粉的AIR并用水洗涤一次来验证淀粉的不存在。对于染色，使用至少2毫克的AIR可以方便地染色淀粉。向AIR中加入500μlLugol碘溶液涡旋，室温孵育5 min，如前所述离心分离上清液，用1 ml水洗涤，离心并除去上清液，并观察AIR的颜色。如果存在淀粉，则AIR将显示为暗色，并且应重复脱粒方案（见附注5;图2）。
  
  图2.使用Lugol碘溶液染色的非破坏性和破坏性AIR的图像
乙酰溴可溶性木质素测定（需要1-2 d）
1. 称量大约5毫克的破坏的AIR，并放入7毫升的玻璃螺旋瓶小瓶中;记录精确质量。直径小于0.5毫米的颗粒物空气的小颗粒不会影响木质素的溶解，因为小的聚集体由于冷冻研磨而对透明的25％乙酰溴是可渗透的，并且在消化过程中可能会崩解。对于每个生物样品，进行一式三份的技术重复。
2. 在化学防护罩中，通过在冰醋酸中稀释制备25％乙酰溴（见附注6）。确保佩戴适当的PPE，并使用玻璃量筒测量和仅玻璃容器，用于涉及乙酰溴的所有步骤。
3. 向每个含有脱气AIR的玻璃管中轻轻加入1ml 25％乙酰溴，轻轻旋转，将AIR混合至25％乙酰溴。还加入1毫升25％乙酰溴到一个空的玻璃管，这将作为一个空白。
4. 将所有样品在70℃下放置1小时，每10分钟轻轻旋转（见注7）。
  注意：如果使用水浴装配大型7 ml管，请确保使用玻璃二次容器，如高玻璃烧杯，以防止管子翻倒。
5. 立即将样品放在冰上冷却。当样品在冰上时，加入5ml冰醋酸，并在化学罩中彻底涡旋
6. 允许任何残留的AIR在室温下沉降至玻璃小瓶的底部至少1小时至过夜。加入冰醋酸后反应完全稳定，对ABSL值的吸光度不受影响;等待任何残留物沉淀是重要的，因为悬浮颗粒可能会干扰分光光度计的准确性（见注8）。
7. 一旦沉降，轻轻地将300μl从每个乙酰溴溶液的顶部转移到石英比色杯，同时避免重新悬浮任何残留的AIR。加入400μl1.5N NaOH，然后加入300μl0.5M新鲜的盐酸羟胺。在加入羟胺盐酸盐（移液管上下〜15-20次后彻底混合，寻找混合溶液的完全混溶性），轻轻取出溶液，直到完全混合在一起，并测量280nm处的空白对混合后立即分光光度计完成。空白由与前述所述相同比例的与1.5N NaOH和盐酸羟胺混合的空白乙酰溴消化样品组成。由于使用单个石英比色杯，每个样品必须在阅读A ^{280之前立即在比色皿中制备。如果A ²⁸⁰测量超过1.000，建议用乙酸稀释混合物，以确保准确的读数，并最佳地观察任何异常特征的结果曲线（参见图3的预期光谱特性）。在计算乙酰溴可溶性木质素的百分比时，除了从1ml消化的其他稀释度外，请务必考虑此稀释因子（见附注9）。
  
  图3.以空白测量的ABSL读数的代表性吸收光谱。吸光度是由于ABSL的存在而导致的，A ⁶⁰⁰是描绘为显示在吸光度读数期间样品中存在的残留AIR颗粒物最少。}
8. 在样品之间，用冰醋酸洗涤比色皿的内部，并用70％乙醇擦拭比色杯的外部。
9. 使用啤酒定律计算具有适当消光系数的乙酰溴可溶性木质素的百分比（见表1;见附注10）。

数据分析

以下公式可用于确定ABS的质量百分比，可以转换为μgmg ^-1 AIR：

哪里，
A ²⁸⁰ = 280nm处的吸光度（空白校正），
ε=消光系数（g ^-1 L cm ^-1），
L =分光光度计路径长度（cm），
D =消化的AIR的稀释因子，
m =去冰空气的质量（mg）。
在几项研究中已经确定了许多生物和组织的消光系数，以解决细胞壁区域内缺乏木质素标准（表1）。约翰逊等人可以找到软木和硬木的附加价值。（1961），但是在23.3-23.6g Lcm ^{-1的范围内（参见附注11）。

表1.木质素定量的乙酰溴可溶性木质素方法的先前确定的消光系数清单}
在计算百分比ABSL后，应用双尾测试用于比较两个样本或单因素方差分析以比较多个样本。

笔记

处理浓缩酸和碱如乙酰溴，冰醋酸和氢氧化钠时，始终佩戴PPE。
在制备AIR之前，可以向每个管中加入3mm玻璃珠，以便离心后使颗粒再悬浮和混合。这将大大加快这一过程，更有效地提取脂质，并保持高产量的AIR，特别是在处理大量样品时。
AIR制备的所有步骤在室温下进行，可以在步骤B4和B8的空气流下在35℃下干燥。不需要使用Reacti-Therm模块，但是由于提供温和的气流和热量，会使样品更快，更均匀地干燥样品。在Reacti-Therm模块中干燥通常， 1小时，当它完全干燥时，颗粒会出现裂纹。这种方法，而不是让样品在化学品通风橱中干燥过夜，这说明了程序部分每个子标题给出的估计时间差异。
还有其他的解决方案是可用的，例如Hatfield等人使用的酶法。（2009）。然而，根据我们的经验（Kapp等人，2015），使用90％的DMSO似乎是更有效的技术。
推荐使用Lugol碘染色，以鉴别淀粉的存在与否，因为染色后含有AIR的淀粉的染色容易，显色较暗。 Lugol的碘染色通常用于染色完整植物组织中的淀粉颗粒，检测灵敏度主要限于视觉限制（Ovecka等，2012）。由于ABSL定量方法相对于细胞壁材料质量（AIR）量化木质素含量，因此淀粉的去除对于精确测定木质素含量是必需的。如果AIR含有淀粉，淀粉将有助于在乙酰溴消化中AIR的总重量，并导致每个样品中细胞壁材料的重量和重量可变，从而降低木质素测定的准确性。
当程序C（乙酰溴可溶性木质素测定）的步骤2中将乙酰溴稀释至25％时，一定要测量发烟乙酰溴到玻璃容器如玻璃量筒或使用玻璃巴斯德吸管。使用微量移液器会导致微量移液器受损，需要修理。
据报道，乙酰溴消化过程持续时间过长或反应温度升高会导致木聚糖降解（Hatfield等，1999）。木聚糖以各种量存在于所有木质化植物组织中;木聚糖降解产生糠醛衍生物，其在270-280nm的范围内吸收，并且可以在ABSL测量期间影响280nm处的吸光度。 Hatfield等人。（1999）建议将消化温度降低至50°C，如果怀疑木聚糖降解产生可变结果，则将孵化时间延长两倍。偶尔，研究人员已经将高氯酸包括在乙酰溴消化中，但是哈特菲尔德等人。（1999）建议排除高氯酸，因为这也增加了木聚糖降解的倾向
我们建议允许剩余的AIR在加入5毫升冰醋酸后，将样品中的残留AIR定位到管底部12-24小时，以防止残留的AIR胶体干扰A ²⁸⁰测量。当将沉降1小时后的A ²⁸⁰的测量值与相同样品的沉降24小时进行比较时，24小时的A ^{280值在0.4-4.4％在1小时记录的²⁸⁰测量，表明在消化和混合冰醋酸之后，A ^{280读数是一致的。}}
稀释因子应根据25毫升乙酰溴消化1毫升的体积计算。对于在0-1.000范围内产生A ²⁸⁰读数的样品，无需稀释，当使用上述方案时，应考虑以下稀释度：加入5ml的6x稀释液的消化后的冰醋酸和在混合300μl消化的AIR材料，400μl1.5N NaOH和300μl盐酸羟胺的混合期间的（10/3）倍稀释，以产生20的总稀释倍数。 />
上述方法在拟南芥基础茎组织的不同生物样品（Xiao等人，2017年）和不同生物样品之间产生了高度一致的结果（
用于在肖氏等人中使用该方法测定拟南芥茎组织中的ABSL含量。（2017），我们选择使用由Chang等人确定的消光系数。（2008），因为这种消光系数是使用与上述在拟南芥（Col-0）茎组织上的方案最相似的方法测定的，并且通过各种拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行实验测定>生态型，允许我们的价值观与以后使用这种方法的其他研究相比较。

食谱

氯仿 - 甲醇混合物
氯仿：甲醇（1：1，v/v）
70％乙醇
100％乙醇（200证明）：双蒸水（7：3，v/v）
25％乙酰溴
乙酰溴：冰醋酸（1：3，v/v）
90％DMSO
双蒸水：DMSO（1:9，v/v）

注意：程序所需的每种混合物的最终体积取决于样品数量。

致谢

这项工作是由美国能源部科学，基础能源科学办公室资助的能源前沿研究中心的木质纤维素结构与形成中心的一部分得到支持，授予＃DE-SC0001090。感谢福斯特等人的作者。（2010年），关于AIR准备的指导和提示，以及Chang等人的作者。（2008年），用于开发不同规模的ABSL方法，并在主题上提供卓越的洞察力和专业知识。作者在提交这项工作时没有兴趣。

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