材料和试剂

注意：所列材料和设备是指Städeleand Stein（2016）使用的设备。逆行细胞外轴突刺激的原理是普遍的，并且程序可以容易地适应于其它制剂。为了降低成本，可以使用具有相同功能的可比较材料，设备和软件。对于公众或教学教室，我们建议使用后院大脑的设备（ https://backyardbrains.com ）。

注射器，充满石油用于制备细胞外记录和刺激井
对于准备注射器，需要以下材料：
1. 石油果冻（100％纯，药店）
2. 100毫升玻璃烧杯（用于熔化凡士林）
3. 5ml鲁尔锁定注射器（例如，BD，目录号：309603）
4. 注射针（20G×1.5"，例如，Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-359535）
5. 沙纸（80至100粒，五金店）
记录/刺激电极
对于制备电极，将需要以下材料：
1. 不锈钢丝，未涂层（A-M系统，目录号：794800）
  低成本替代方案：Minutien针脚（见下文）或缝纫针脚
2. 电线，红色和黑色PVC绝缘（Southwire，型号：22号，目录号：57572444，五金店）
3. 剥线钳（五金店）
4. 针尖钳（五金店）
5. 热缩管（五金店）
6. 锡焊，3/32英寸（Forney，目录号：38109）
用硅弹性体（例如，Sylgard 184，Sigma-Aldrich，目录号：761036;或Elastosil RT 601，Wacker Chemie，目录号：60063613）衬里的培养皿
Minutien针（精细科学工具，目录号：26002-10）
造型粘土（工艺品店）
解剖神经系统
注意：我们正在使用从The Fresh Lobster Company（格洛斯特，马萨诸塞州）购买的成年约拿蟹（Cancer borealis）。
生理盐水（见食谱）
C的食谱。北欧盐水可以在表1中找到
1. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
2. 氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
3. 氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
4. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
5. Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
6. 马来酸（Sigma-Aldrich，目录号：M0375）

设备

加热板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Nuova ^TM搅拌HotPlates，目录号：SP18425Q）}
立体显微镜（例如，，Leica Microsystems，型号：MS5）
刺激器（A.M.P.I，型号：Master8 Pulse Stimulator）
低成本替代方案：Pulse Pal V2（Sanworks，目录号：1102）
放大器（A-M系统，型号：差分AC放大器1700，目录号：690000）
低成本替代品：Spikerbox（Backyard Brains，型号：Neuron SpikerBox）
数据采集板（CED，型号：Power 1401-3A）
低成本的替代方案：通过使用BYB Spike Recorder，可以使用计算机/笔记本电脑上的麦克风插孔和声卡对数据进行数字化。第二种低成本的替代方案是Spikehound（ http://spikehound.sourceforge.net ），这也允许通过计算机声卡记录
焊接站（Apex工具，Weller，型号：Station 50/60W 120 V WES51，目录号：WES51）
电压表（FLIR Systems，Extech，型号：EX330，目录号：203489911）
镊子（例如，，Fine Science Tools，型号：Dumont＃5，目录号：11251-10）

软件

录音软件（Spike2版本7.12，剑桥电子设计有限公司）
低成本替代方案：BYB Spike Recorder（免费软体，可在 https：//backyardbrains .com/products/spikerecorder ）或Spikehound（ http：//spikehound.sourceforge。网）

程序

图1说明了实验装置和电极放置。为了刺激轴突，通过使用凡士林，一部分感兴趣的神经将与神经系统的其余部分电隔离。刺激的成功将通过在轴突的空间上远离的部分细胞外记录所引起的AP来监测。

图1.实验装置和电极放置示意图。说明了含有神经的培养皿。蓝色圆筒代表石油井，黑线表示电极放置及其与刺激和记录设备的连接。

制备凡士林注射器
1. 将果冻转移到玻璃烧杯中。
2. 将玻璃烧杯放在加热板上并加热加热，直至其充分熔化。
  注意：凡士林的熔点在45°C和60°C之间。避免沸腾！沸腾会产生气泡。
3. 取5毫升鲁尔锁定注射器，并将熔化的果冻通过尖端拉出，将其填满。
  注意：戴上手套以防止灼伤。
4. 让填充的注射器坐在室温下，直到果冻固化。
  注意：为防止气泡，请将注满的注射器向上（尖端朝向天花板）放置，直至果冻固化。
5. 使用切线钳切断20针注射针尖。
  注意：使用砂纸来平滑锋利的边缘。
6. 将注射针的前部弯曲约70°的角度（图2）。
7. 将针头插入注射器。
  
  图2.用于制备细胞外刺激/记录孔的石油冻胶注射器
准备刺激和记录电极
注意：重复以下步骤以创建包括刺激，记录和接地电极在内的所有必要的电极。刺激和记录电极需要红色和黑色线，而地面只需要一根线。
1. 将电线切割成所需长度。
2. 使用剥线钳去除每根红/黑线两侧绝缘层的5〜10毫米
3. 使用预热烙铁，并用锡焊料涂覆电缆的剥离部分（图3A）。
4. 用针尖钳将锡焊包线部分弯曲成环（图3B）
5. 将不锈钢丝穿过环路。
  注意：不用不锈钢丝，也可以使用细节或缝纫针。
6. 用锡焊填充回路以将不锈钢丝连接到黑/红线（图3C）。
7. 使用电压表检查不锈钢线是否与导线正确接触。
8. 将合适的插头焊接到电缆的另一侧以将其连接到刺激器/放大器。
9. 使用热缩管将空白焊点绝缘。
10. 除了刺激和记录电极之外，还需要单个接地电极来减少记录噪声和刺激伪影。使用黑色线重复上述步骤以构建单个电极。
  
  图3.细胞外刺激/记录电极的制备。 A.带有绝缘和锡焊锡涂层前面部分的电线B;相同的线，弯曲成环; C.不锈钢丝与锡焊接在一起。
解剖感兴趣的神经
注意：对于详细的方案，如何解剖C. borealis的口腔胃肠神经系统请参阅（Gutierrez and Grashow，2009）。
将神经系统转移到硅胶衬里的培养皿上注意：硅弹性体应涂覆培养皿的底部〜5毫米。
把神经系统放在盘子的中间。
1. 用生理盐水填充陪替氏培养皿（见表1，见北极生理盐水）。
2. 使用细节针来安装神经系统，通过直接固定在神经末端或通过钉扎仍然附着到神经系统的结缔组织。
  注意：不要穿过被记录的神经部分，因为这会损伤轴突。
通过用造型粘土将其固定在工件表面上（图4）将盘从位移中固定
将接地电极放入浴中。使用造型粘土防止接地电极发生位移。将接地线连接到放大器地。

图4.具有孤立口腔胃神经系统的培养皿。照片显示刺激和记录孔沿口胃神经，盐水流入和流出以及接地线的位置。培养皿用造型粘土附着在工作面上。对于细胞外刺激和记录，不需要隔离实验台。为了更好的可视化，神经被回溯（灰色和粉色线）。
准备细胞外刺激/记录井。
1. 使用立体显微镜，在图5所示的充气注射器上，在感兴趣的神经的两个位置上形成两个同心圆。一个孔将用作刺激，另一个将用作记录。加入石油胶层，直到孔延伸到盐水位以上（图5A和5B）。
  注意：由于凡士林不导电，所以将井的一小部分神经与其余的浴隔离。
2. 确保井紧密而不漏水。
  注意：在井内添加一滴或两滴盐水。如果生理盐水的水平不下降，则井足够紧密，并将神经部分与其余部分隔开（图5C）。
  
  图5.石油凝胶井制备。A.在感兴趣的神经的一小部分周围形成初始同心圆。成绩好加入石油冻胶层，直到最上面的层从盐水中延伸出来。 C.泄漏试验。将盐水加入孔内以测试是否将神经部分与其余浴室充分隔离
放置刺激电极。

用刺激器连接刺激电缆（红线=阴极，黑线=阳极）。

使用镊子将钢丝（阴极）放置在刺激井内（图6）。将线牢固地插入硅胶中。
注意：避免穿刺神经或良好。将电极的末端足够深地放入硅胶中，以便在实验的剩余时间内，导线不会在任何时候脱落。

使用镊子将阳极放置在井外，但仍然靠近。
注意：电线不能互相接触，因为这将导致短路，轴突不会被刺激。

使用造型粘土固定电线。

图6.刺激丝在石油井中的布置
对记录线重复步骤8。
转动细胞外放大器，并检查自发性AP是否在细胞外记录上可见。
注意：

对于C. borealis，放大器滤波器设置应该：放大：10,000;高通滤波器：低截止频率100 Hz;低通滤波器：高截止频率500 Hz。

检测到的AP波形不直接反映膜电位变化。使用记录井的内部和外部之间的差分记录来检测AP。
刺激神经细胞外。
最初，将Master8上的刺激参数设置为1 ms刺激脉冲持续时间，1 Hz刺激频率和0 nA/Volt。在确定刺激阈值之后，可以使用更多的生理参数。

使用细胞外记录首先识别刺激伪影（图7A和7B）注意：刺激伪影可以很容易地与AP区分开，因为人造物的大小随着刺激振幅线性增加。如果刺激伪影太大，则电缆的极性应相反。当阴极（而不是阳极）放置在刺激井内部时，刺激伪影将最小。

图7.细胞外刺激阈值的调整。 显示亚阈值（A，B），阈值（C）和上阈值刺激（D）期间口腔胃神经系统神经的细胞外记录。 A.在亚阈值刺激与低刺激幅度下只有刺激伪影可以观察到，但没有AP。伪像与刺激脉冲同时发生。 B.增加刺激幅度低于阈值不会引起AP，但增加刺激伪影幅度。将刺激振幅增加到阈值引起AP。其波形在刺激伪影（灰盒）后出现固定的时间延迟。首先招募直径最大的神经轴突。注意，AP波形不表示AP的不同相位，而是AP的进入和离开井之后的石油井内外的潜在差异。 D.增加超过阈值的刺激振幅招募额外的较小直径的轴突。注意，当招募其他轴突时，检测到的波形的形状和幅度变化（复合AP）。为了更好的可视化，伪影幅度被裁剪（用*表示）。

通过缓慢增加刺激幅度直到AP变得可见来确定刺激阈值（图7C）注意：AP应在刺激伪影之后出现时间延迟。 AP可以与伪像区分开来，因为它们仅在达到刺激阈值之后发生，并且它们的发生时间和幅度不随刺激振幅线性增加。请注意，如果刺激幅度进一步增加，可能会招募来自其他轴突的AP，这将改变检测到的信号的大小和形状（复位AP在超阈值刺激期间，参见图7D和视频1）。 >

如果记录软件具有触发功能，可以使用它来控制细胞外记录的扫描，以允许快速的时间基准，以及刺激伪影和AP形状的比较。

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视频1.视频剪辑说明亚阈值，阈值和超阈值刺激

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数据分析

数据分析将根据实验而有所不同，但在设计使用细胞外轴突刺激的实验时，应牢记以下步骤。

为了确保AP被引出，必须区分刺激伪影和记录站点的到达AP。激发的AP在刺激脉冲之后以恒定的延迟到达，并且与刺激振幅无关（图7C）。相比之下，刺激伪影随着刺激振幅而缩放，几乎瞬间到达（图7A和7B）。
在亚阈值刺激振幅下，只有刺激伪影是可见的（图7A）。为了测试记录的信号是否确实是人造物，可以使用垂直光标测量刺激开始与记录位置的信号到达之间的时间。对于信号到达，可以使用信号的第一个明显的峰值。此外，应使用水平光标在信号最小值和最大值之间测量到达信号的幅度。平均至少要连续10次刺激，以确定平均到达时间和幅度
稍微增加和减少刺激振幅，并再次测量记录信号的到达时间和幅度。如果到达时间发生在刺激脉冲和振幅与刺激振幅（图7B）相比的同时，记录的信号是刺激伪影。在每个刺激振幅下测量至少10个连续的信号。
注意：可以使用t检验来比较不同刺激幅度下的测量值（显着性切断值P <0.05）。
进一步增加刺激振幅，直到第二个延迟信号到达记录位置（阈值刺激，图7C）。如果这是AP，当刺激振幅提高时（不会缓慢增加），应该突然发生。测量至少10个连续AP的到达时间和振幅。
注意：AP不受刺激振幅变化的影响。通过在测量到达时间和幅度之前稍微增加刺激振幅，确认记录的信号确实是AP。 AP的到达时间取决于刺激和记录位点之间的距离。
进一步增加刺激幅度（阈值，图7D）可以招募额外的AP，其延迟和幅度可以使用相同的分析来测量。

笔记

在尝试轴突刺激之前，记录至少10个连续AP的自发性AP活动。可能需要通过将刺激器接地到放大器并利用法拉第笼来进一步降低噪音
代替钢，氯化银可用于接地线。如果计划额外的细胞内记录和/或必须避免记录的膜电位的漂移，这是特别重要的。
如果刺激伪影较大并且持续时间较长，则刺激器的阳极和阴极可能反转。在这种情况下，刺激电极的极性需要反转，因为阳极导致细胞外空间变得更积极，因此神经元在局部极化。由于这种超极化被相对地被去极化的区域包围，AP仍然可以被引发（阳极刺激）。然而，通过阳极刺激刺激的AP具有更高的阈值，导致刺激伪影更大
如果没有细胞外记录的刺激神经是可行的，刺激的成功可以通过监测突触后神经元，电路，肌肉或行为的活动的变化来评估。在这种情况下，建议使用较高的刺激频率来实现清晰的突触后反应。

食谱

癌症北极生理盐水配方（见表1）

表1. 生理盐水配方

注意：使用Trizma碱和马来酸将pH调节至7.4-7.6。

致谢

这项工作得到了德意志民主共和国（DFG STE 937/9-1），国家科学基金会（NSF IOS 1354932），伊利诺伊州立大学和德国学术交流处的资助。

参考文献

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Basser，PJ和Roth，BJ（2000）。新电刺激可激活组织的电流。 Annu Rev Biomed Eng 2：377-397。
Cogan，SF（2008）。神经刺激和记录电极 Annu Rev Biomed Eng 10：275-309。
Gutierrez，GJ和Grashow，RG（2009）。 < （胃癌）口腔胃神经系统解剖。 J Vis Exp （25）
Städele，C.和Stein，W.（2016）。自发性异位癫痫发作的部位促进感觉神经元中的信号整合。 Neurosci 36（25）：6718-6731。