材料和试剂

注意：所列材料和设备是指Städeleand Stein（2016）使用的设备。为了降低成本，可以使用具有相同功能的可比较材料，设备和软件。对于公众或教学教室，我们建议使用后院大脑的设备（ http://backyardbrains.com ）。

用硅弹性体（例如，Sylgard 184，Sigma-Aldrich，目录号：761036）或Elastosil RT 601（Wacker Chemie）衬里的培养皿（100×15mm，Fisher Scientific，目录号：FB0875713），目录号：60063613）
Minutien针（精细科学工具，目录号：26002-10）
造型粘土（工艺品店）
注射器，充满果冻（100％纯，药店）
记录/刺激电极
注意：有关如何准备充气注射器或记录/刺激电极的详细信息，请参阅Städele，C.，DeMaegd，M。和Stein，W.的"伴侣协议"细胞外轴突刺激。 />
解剖神经系统
注意：我们正在使用从The Fresh Lobster Company（格洛斯特，马萨诸塞州）购买的成年约拿蟹（Cancer borealis）。
生理盐水（见食谱）
C的食谱。北欧盐水可以在表1中找到

氯化钠，NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
氯化镁六水合物，MgCl 2·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
氯化钙脱水剂，CaCl 2·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
氯化钾，KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
马来酸（Sigma-Aldrich，目录号：M0375）

设备

标尺或千分尺
立体显微镜（例如，Leica Microsystems，型号：MS5）
刺激器（A.M.P.I，型号：Master 8 Pulse Stimulator）
低成本替代方案：Pulse Pal V2（Sanworks，目录号：1102）
放大器（A-M系统，型号：差分AC放大器1700，目录号：690000）
低成本替代方案：Spikerbox（Backyard Brains，型号：Neuron SpikerBox）
数据采集板（剑桥电子设计有限公司，型号：Power 1401-3A）
低成本的替代方案：通过使用BYB Spike Recorder，可以使用计算机/笔记本电脑上的麦克风插孔和声卡对数据进行数字化。第二种低成本替代方案是Spikehound（ http：//spikehound。 sourceforge.net ），这也允许通过电脑声卡进行录制。
相机（例如，，AmScope，型号：3MP USB2.0显微镜数码相机，产品目录号MU300）

软件

ImageJ（国家卫生研究院）或类似软件
录音软件（Spike2版本7.12，剑桥电子设计有限公司）
低成本替代方案：BYB Spike Recorder（免费软体，可在 https：//backyardbrains.com/products/spikerecorder ）或Spike猎犬（ http：//spikehound。 sourceforge.net ）

程序

图1说明了实验装置和电极放置。为了确定AP传导速度，重要的是要记住，测量受激AP（图1A）和自发产生的AP（图1B）的过程存在差异。特别是在后一种情况下，至关重要的是AP将不会在两个记录站点之间启动，因为这将导致错误的速度测量。 AP可以从其启动位置双向传播，并且如果在两个记录站点之间启动AP，则记录站点之间的AP到达时间的测量差异不代表移动到两者之间的距离的AP（图1C，也是步骤B2）。因此，在下文中，给出了测量传导速度的详细步骤：
A.通过细胞外刺激刺激AP B.自发发起的受影响人士
在这两种情况下，AP传导速度作为AP需要从轴突/神经上的一个位点行进到另一个位点（="潜伏期"）的时间的函数。传导速度可以用以下公式计算：

以 v 为传导速度，
作为记录站点之间的空间距离，Δx，
作为记录站点之间的时差（延迟），Δt

图1.用于测量受激AP（A）和自发产生的AP（B& C）的传导速度的电极放置的表示。A.左：AP在刺激井内启动并传播轴突（绿色箭头）朝向记录井。请注意，AP是双向传播的，但只在记录位点被检测到。 Δx表示刺激和记录井之间的距离。右：神经的细胞外记录显示刺激发作（刺激伪影）和AP（灰盒）之间的延迟（Δt）。 B.左：用于测量自发产生的AP的传导速度的正确的电极放置。记录井需要以这样一种方式进行放置，使得AP正在通过井而不在井之间启动。右：两个记录站点AP发生的延迟反映了AP需要从记录1传播到记录2的时间。C.左：用于测量自发生成的AP的传导速度的电极放置不正确。右：两个录音站点之间的延迟很小，只反映了AP在空间上比录音1更接近录音2。

测量刺激AP的传导速度
测量受激AP的传导速度的优点是AP启动由实验者控制。因此，可以测试不同的AP频率，并且可以在许多不同的条件（例如，在不同的温度或不同的神经调节条件下）可靠地引出AP。然而，由于最大的轴突对最低的刺激幅度有反应，所以测量小直径轴突的速度可能与细胞外刺激是不可行的。
1. 解剖感兴趣的神经。
  注意：解剖的神经应该足够长，使步骤2中构建的两个孔是分开的，并且神经的整个长度包含感兴趣的轴突。有关详细的方案如何解剖C. borealis的胃口胃神经系统，请查看Gutierrez和Grashow（2009）。
2. 建立细胞外记录和刺激，如Städele，C.，DeMaegd，M.和Stein，W的伴随方案"细胞外轴突刺激"所述。对于电极放置，参见图1A。
3. 确定AP刺激阈值后，用低频刺激（1〜2Hz）持续刺激轴突
4. 识别细胞外记录上的AP（图1A，右图）。
  注意：刺激的AP将从刺激电极行进到记录位置。从一个刺激脉冲到下一个脉冲，AP幅度和形状不应该改变。类似地，刺激开始和AP发生之间的等待时间应保持不变。如果没有AP幅度或延迟的一致性，则不会引起AP或引发的AP不通过记录位点，表明轴突可能被损坏或可能通过不同的神经投射。 >
5. 测量传导速度，如数据分析所述
6. 实验的变化：在许多轴突中，AP传导速度是频率依赖性的（Miller和Rinzel，1981; Weidner等人，2002）和/或历史依赖性（Ballo等人，，2012; Kiernan等人，1997）。为了测试感兴趣的轴突是否是这种情况，增加刺激频率并观察传导速度是否随着AP的频率和/或数量的变化而变化。代替以恒定频率刺激，可以应用更多的生物相关脉冲序列，例如频率上的突发样变化（Ballo和Bucher，2009）。
测量自发生成的AP的传导速度
自发发生的AP的传导速度测量不需要细胞外神经刺激。许多轴突自发产生AP，因此大多数神经记录显示出自发发生的AP。通过使用自发产生的AP，可以评估小直径轴突的传导速度。然而，实验者无法控制AP的发生和频率。作为例子，我们正在使用约纳蟹（胃癌）胃口胃神经系统的前胃部受体神经元（AGR; Smarandache和Stein，2007）。 AGR自发产生可以用细胞外电极测量的轴突干细胞（2〜5Hz）的强直刺激活性（Daur等人，2009;Städeleand Stein，2016）。
1. 解剖感兴趣的神经。然后，代替一次刺激和一次记录，两者都将用作记录孔（图1B）。
2. 将刺激电极的电缆连接到细胞外放大器的第二个通道。
  注意：如果感兴趣的神经元是双极的或能够产生异位AP（例如，Daur等，2009），请确保启动AP的位置不在两个记录孔之间，因为测量的延迟不会反映记录站点之间的旅行时间（图1C）。如有必要，可以通过添加第三记录井确定。 AP到达记录井的顺序将指示启动地点。如果两个外部井中的任一个首先记录了AP，则可以使用其他记录井之间的到达时间差来测量正确的速度。如果中心井首先记录AP，则在中心井和外部井之间使用最长的延迟。
3. 识别细胞外记录上感兴趣的AP。
  注意：感兴趣的AP应在两个记录站点之间以一定的延迟出现。其形状和幅度在记录位置之间可能不同，但对于每个位置应该是一致的。如果感兴趣的AP不是细胞外记录上的最大单位，或者由于其他原因难以识别，请参见注释。
4. 测量传导速度，如数据分析中所述。

数据分析

测量两个记录站点AP出现之间的延迟。

对于受刺激的AP，测量刺激和记录的AP之间的时间差，如图1A所示注意：刺激发作可以使用刺激伪影确定，刺激伪影几乎瞬间通过培养皿传播。在录音软件中，测量刺激伪影的峰值与记录的动作电位的峰值之间的时间。
对于自发诱发的AP，测量记录1和记录2之间AP的峰值之间的时间差，如图1B所示。

测量记录位置之间的距离。
使用标尺或千分尺来测量刺激和记录孔之间的神经长度。应测量两口井之间的最短距离（边缘到边缘）。有不同的方法可以用来测量距离。最简单和最不精确的方法是使用标尺或千分尺。一个更准确的方法是：

将尺寸标准放在陪替氏培养皿下方（例如，千分尺）。
拍摄照片，显示刺激和记录之间的距离加上尺寸标准。
使用ImageJ（国家卫生研究院）或类似的软件来测量两口井之间的神经距离。使用尺寸标准来校准软件中的距离测量。

使用公式1计算传导速度。
注意：为了获得更准确的结果，请计算，然后平均至少10个AP的传导速度。
在比较两种不同条件（例如，神经调节剂应用前后）的传导速度时，使用配对的 em> P 0.05。
当比较来自同一动物的不同条件（例如，多个神经调节剂的应用或测量是多个温度）的传导速度的多次测量时，使用重复测量方差分析（ANOVA）

笔记

使用多扫描和平均值来提高测量精度。为了测量刺激伪像和记录（或记录1和记录2之间）之间的延迟，不仅使用单个AP是有帮助的。相反，应考虑多个接入点（视频1）。这不仅可以使时间相关AP的识别更容易，而且可以评估在不同条件下可能发生的传导速度的变化和变化。使用触发的扫描显示（示波器视图或"多扫描"视频2），最容易检测到时间相关的AP。在这种观点中，叠加了多次相同的AP，以显示分别以刺激或其他记录的固定延迟发生的AP。为此，在软件中设置幅度阈值，AP必须通过该阈值上升才能开始新的扫描（"触发"）。因此，只有足够超过阈值的AP才能触发新的扫描，并且这些AP到达记录站点的延迟变得明显。如果将阈值设定得较低，则可以检测多个轴突的AP。根据它们的传导速度，它们可以在记录时到达不同但固定的时间。其他轴突的AP不会被时间锁定到触发器上，因此在显示器上随机发生。使用触发的扫描显示器特别有助于检测自发生成的AP，因为使用单个AP或没有适当分析难以确定两个记录位点之间的时间相关性。
为了确定准确的延迟，平均几次触发的AP（视频2）可能是有帮助的。在这种情况下，所有随机发生的AP将是小的或不存在的，并且只有时间锁定的AP显示可以容易地测量的清晰的峰。

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视频1.使用Spikerecorder软件（后台脑）自动产生的AP的时间相关AP的视频剪辑。 类似的过程可用于受刺激的AP。

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视频2.视频剪辑说明尖峰触发多扫描，并使用Spike 2软件（CED）对自发生成的AP进行平均。 类似的过程可用于受刺激的AP。

<！ - flashid2152v177结束 - >
噪音问题电噪声是与记录神经元信号相关的常见问题。电噪声的主要来源是拾取，这是由电气设备和记录设备的辐射引起的。该辐射在电极和导线中产生通向记录系统中的放大器的电流。由于大多数器件由60 Hz（US）/50 Hz（大多数其他国家）交流供电，因此拾音器将显示为16.7（US）/20（其他）毫秒的失真正弦波。通过在准备物和电极周围使用接地的金属外壳（法拉第笼）可以降低噪音。外壳将辐射源与电极分开。将所有记录和刺激设备接地到单个来源将降低噪音。这可以使用一侧的鳄鱼钳的香蕉插头将录音和刺激设备的接地端口连接到法拉第笼。有关法拉第笼功能的原理的更多信息，请参阅Chapman等人。（2015）和DeFreitas等人。（2012）。操作设备的人也可能是噪音源，他或她也可能需要接地。此外，屏蔽电缆可用于将信号从电极传送到放大器。
如果信噪比仍然很小，则问题可能源于小信号而不是大噪声。在这种情况下，记录井很可能是泄漏的，应该进行重构。

食谱

癌症北极生理盐水配方（见表1）

表1. 生理盐水配方

注意：使用Trizma碱和马来酸
调整pH至7.4-7.6

致谢

这项工作得到了德意志民主共和国（DFG STE 937/9-1），国家科学基金会（NSF IOS 1354932），伊利诺伊州立大学和德国学术交流处的资助。

参考文献

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