材料和试剂

粪便等分和粉碎
1. Versi-dry sheet（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：74018-00）
2. 大金箔（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34721）
3. 超重型铝箔（VWR，目录号：89107-734）
4. 干冰
5. 液氮和杜瓦以及泡沫塑料杯
6. 冷冻箱中预先标记的螺旋管（STARSTEDT）（每个样品4个预先标记的管）
7. 粪便刮刀（以6组高压灭菌）（Fisher Scientific，目录号：21-401-25B）
8. 灭菌袋（小）
9. 高压灭菌袋
10. 漂白剂（5.25％次氯酸钠溶液）
11. 75％EtOH
病毒样颗粒（vlp）制剂
1. 无菌1.5毫升和2.0毫升螺旋盖管
2. 1 ml luer-lok注射器（BD，目录号：309628）
3. 直径为13 mm的0.45μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLHV013SL）
4. 直径为13 mm的0.22μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGV013SL）
5. 1 M Tris，pH 7.5（Fisher Scientific，目录号：MT-46-030-CM）（Tris 1M pH 7.5，DNase-，RNase-，不含蛋白酶的[6×1L瓶]）
6. 5 M NaCl（Promega，目录号：V4221）（5M NaCl 1L瓶，DNase-，RNase-，不含蛋白酶;等分在1ml等份中并储存在-20℃）
7. 盐水镁（SM）缓冲液（Fisher Scientific，目录号：50-329-444）（SM缓冲液，明胶pH 7.5,100ml）
8. 10％SDS（从20％SDS储备[Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM9820]在RNase，DNase，不含蛋白酶的H 2 O中稀释;等分和储存于-20°C）}
9. 溶解酶（10 mg/ml）（EMD Millipore，目录号：71412） - 等分并储存于-20°C
10. Turbo DNase I（2U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM2238）
11. 碱基零DNase（1U /μl）（Epicentre，目录号：DB0711K）
12. 氯仿（Fisher Scientific，目录号：C298-500）
13. 苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）pH8.0（Fisher Scientific，目录号：BP1752I-100）
14. QIAGEN DNeasy血液和组织试剂盒（QIAGEN，目录号：69506）
15. CTAB（Sigma-Aldrich，目录号：52365）
16. CTAB/NaCl（参见食谱）[0.45μm过滤+0.22μm过滤]
图书馆建设
1. GenomiPhi V2 DNA扩增试剂盒（GE Healthcare，目录号：25-6600-31）
2. Covaris microTUBE AFA纤维卡帽50μl（Covaris，目录号：520045）
3. NEBNext ^® Ultra ^TM Illumina的DNA文库准备工具包（New England Biolabs，目录号：E7370L，96 rxns）
4. NEBNext ^® Illumina的复用Oligos ^®
  Index Primers Set 1（New England Biolabs，目录号：E7335L）
  Index Primers Set 2（New England Biolabs，目录号：E7500L）
5. AMPure XP珠（Beckman Coulter，目录号：A63881）
6. TE低EDTA
7. D1K试剂（Agilent Technologies，目录号：5067-5362）
8. 用于TapeStation的D1K屏幕胶带（Agilent Technologies，目录号：5067-5361）

设备

生物安全罩
6支砂浆/杵，100毫升容量
烧杯
微量离心机
PCR罩
-80°C冰箱
Covaris E210
PCR热循环仪（Eppendorf）
NanoDrop微量紫外 - 可见分光光度计
Agilent 2200 TapeStation（Agilent Technologies，型号：2200 TapeStation）
载入TapeStation的技巧（Agilent Technologies，目录号：5067-5153）
Dynamag ^TM旋转磁铁（Thermo Fisher Scientific，目录号：12320D）

程序

粪便等分/粉碎
注意：所有步骤都是在生物安全罩中进行的，因为使用人类粪便和存在感染性生物体的风险。
1. 砂浆和杵的洗涤和制备
2. 粪便粉碎
VLP浓缩方案
1. 将上述粉碎至200mg的粪便放入干冰中的无菌2ml螺旋盖管中以保持冷冻
2. 每个样品加入400μl冷SM缓冲液。保持在冰上高速涡旋5分钟。
  注意：如有可能，可以使用2 ml管接头板将所有样品管保持在一起。加入试剂时，避免接触尖端至管。更改样品之间的提示，以避免交叉污染。低速离心法用于避免细菌裂解。目标是让一切都变成解决方案。如果需要，可以添加更多SM缓冲区。
3. 在4℃下以2,000 x g离心10分钟。将上清液转移至干净的1.5 ml Eppendorf管中。在4℃下以2,000×g离心分离10分钟。
  注意：有时需要第三次旋转以澄清上清液。最后的上清液体积应至少为200μl，因为在随后的过滤中体积的一部分将会丢失。如果需要，可以添加更多的SM缓冲区。
4. 过滤上清液一次通过0.45μm过滤器。然后通过0.22μm过滤器过滤两次。所有过滤步骤均使用1毫升鲁尔 - 洛克注射器和13毫米直径的过滤器。
  注意：通过0.22μm过滤器过滤一次是足够的，但在该手稿中使用2×0.22μm的过滤步骤。如果过滤器堵塞：拉出柱塞以释放压力，取下过滤器并重新打开。如果初始样品体积较低，可能需要使用移液管从旧的堵塞过滤器中回收剩余的样品。
5. 检查滤液的最终体积。用冷SM缓冲液加至200μl。
6. 溶菌酶/氯仿/DNA酶处理
  1. 向每个管中加入20μl（10％体积）溶菌酶（10mg/ml储备液）。在37°C孵育30分钟。
  2. 加入44μl（20％体积）氯仿，短暂涡旋，并在室温（RT; 15-25℃）下孵育10分钟。
  3. 在室温下以2,500 x g离心5分钟。
  4. 收集水相并转移至2 ml螺旋盖管注意：螺旋盖最好用于防止加热过程中顶部出现的样品损失。
  5. 使DNase主机混合。
7. 在每个管中加入50μlDNase主混合物。在37°C孵育1 h。
8. 在65℃下热灭活DNase 15分钟，然后快速旋转以拉下冷凝。
9. SDS/CTAB清理
注意：以下所有步骤均在PCR引擎盖中进行。
1. 使用QIAGEN DNeasy血液和组织试剂盒清洁DNA。在200μl洗脱缓冲液中洗脱。
  注意：从动物血液或细胞方案的总DNA纯化中的缓冲液AL步骤开始。可以使用其他柱清洁试剂盒，但在比较用样品之间应保持一致。我们建议只保留大范围DNA的清理工具。
Phi29聚合酶扩增
注意：使用GenomiPhi V2 DNA扩增试剂盒将4μl独立MDA反应中的每个样品2μl用作模板，以减少扩增偏差。然后在MDA之后合并4个重复，并由NanoDrop定量
1. 将8μlGenomiPhi V2 DNA扩增试剂盒样品缓冲液+ 2μl模板加入干净的0.5 ml PCR管中。
2. 在95℃下加热3分钟，然后在冰上冷却至4℃。保持冷。
3. 准备冰上的主人混合：
4. 每管加入10μl上述主混合物，并返回热循环仪。
5. 加热至30°C 2 h。然后在65℃下热灭菌10分钟。冷却至4°C。可在-20°C储存。
  注意：孵化时间应优化到允许充分放大以最小化放大偏差的最短时间。
6. 从同一个样品中汇集4个独立的MDA反应。将体积调节至200μl，不含DNase的H 2 O。
7. 使用QIAGEN DNeasy血液和组织试剂盒纯化MDA产品。在100μl缓冲液AE中洗脱，通过柱一次循环以提高产量。
Covaris分裂与Covaris E210
1. 在Covaris弹簧管中将200 ng DNA稀释至每个样品50μl总体积dH 2 O。
  注意：在此步骤中增加到500ng DNA不会增加不同病毒序列的数量。
2. 预冷Covaris。
3. 片段核酸使用400设置根据Covaris手册：强度5，占空比5％，每爆发200次循环，处理时间55秒，温度7℃，水位6，样品体积50微升。
4. 如果立即进行下一步（推荐）或在-20°C保存供以后使用，请取出样品并存放在冰上。
NEBNext DNA文库构建
注意：根据NEBNext ^®执行Ultra ^TM用于Illumina手册协议的DNA文库准备工具。
1. 结束修复
  1. 将DNA加入到具有dH O的55.5μl。
  2. 加入6.5μl终止修复反应缓冲液
  3. 加入3μlEnd Prep酶混合物
  4. 在热循环仪中：
    20°C 30分钟
    65°C 30分钟
    4℃保持
2. 适配器结扎
3. 将3μlUSER酶加入到连接混合物中，并在37℃的热循环仪中加热15分钟
4. 适用于400-500bp文库产品（300-400bp插入片段）的AmPure小珠大小选择
  1. 向连接反应物中加入13.5μl无核酸酶的H 2 O，终体积为100μl。
  2. 加入40μlAmPure珠，并通过上下移液充分混合。
  3. 在室温下孵育5分钟
  4. 离心管短暂。放在磁铁上并在室温下孵育5分钟（直到清除）
  5. 将上清液转移到干净的管中。
  6. 加入20μlAmPure珠，并充分混匀。在室温下孵育5分钟
  7. 离心管短暂。放在磁铁上，在室温下孵育5分钟
  8. 将管放在磁铁上，取出并弃去上清液，小心不要脱落珠粒。
  9. 用磁铁管，加入200μl新鲜制备的80％EtOH，并在室温下孵育30秒
  10. 用磁铁上的管子，去除EtOH洗涤液。
  11. 重复步骤E4i和E4j两次，共3次洗涤。
  12. 空气干燥珠在RT上10分钟，磁头上的管顶部打开。
  13. 从磁铁中取出管，加入28μlTE低浓度EDTA，pH8至珠子，并通过旋转或通过移液进行良好的混合重新悬浮。
  14. 短暂离心管，更换磁铁上的管，并在室温下孵育5分钟，或直到清除。
  15. 收集23μlDNA并转移到干净的PCR管中。确保不要转移任何珠子。
5. PCR扩增
6. PCR清除
7. 根据TapeStation HS DNA方案测定TapeStation HS DNA上的文库产量和质量。
8. 池样品（〜12个样品/运行，等摩尔）至最终浓度为10 nM，并验证TapeStation HS DNA上的浓度。
9. 根据设施协议和建议提交Illumina Miseq（我们使用负载浓度7 pM，1％PhiX spike-in，Std流通池，2 x 250 bp运行）。
  注意：此协议也适用于Illumina Hiseq。

数据分析

序列分析方法由于硬件速度和软件编码的进步而迅速发展。许多序列处理软件工具是开源的（例如BBTools， http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/），以及R中的统计分析和图表包（ https://www.r-project.org/）。我们使用VirusSeeker（Zhao等人，2017年），一种基于VirusHunter（Zhao等人，2013）的定制自动化生物信息学管道，以检测共享核苷酸和氨基酸的序列酸序列与已知病毒的相似性（图1）。我们建议使用严格的病毒序列鉴定方案，例如VirusSeeker，可以去除低质量序列，重复序列和非特异性病毒"命中"。同样严格的方法也确定了新型病毒序列（Zhao等，/em>。，2013）。分析协议中的基本步骤如图1所示。在从NCBI数据库中下载与所有病毒基因组相对应的序列后，可以生成自定义病毒数据库（记录下载的日期，因为频繁添加新序列）。推荐使用重复数据删除来最大限度地减少放大偏差，并且分类群分配的序列应归一化以考虑采样间序列深度的变化。应使用特异于病毒序列的引物，通过实时qPCR来验证新的病毒序列或感兴趣的病毒序列。另外，序列可以从头开始组装成更长的重叠群，并与NCBI nr/nt数据库进行比较，以更好地鉴定感兴趣的病毒序列的系统发育（Monaco等人，2016年））。将感兴趣的序列与已知的相关病毒序列进行比较的系统发生树可以使用诸如FigTree的免费软件（ http://tree.bio.ed.ac。 uk/software/figtree/）。

图1.序列分析原理图

笔记

进行粪便粉碎以均匀分布样品中的微生物物质。使用含有明胶的SM缓冲液在冷冻后稳定噬菌体群体，以进一步表征感兴趣的噬菌体，包括培养。由于污染风险，试剂应仅用于粪便微生物组研究。对于所有Illumina Miseq运行使用相同的试剂（ ie ，同一瓶无菌水，试剂盒，等等），许多试剂可能被微生物DNA污染，确保跨运行均匀的污染。

食谱

CTAB/NaCl
3.5ml 5M NaCl（最终浓度0.7M）
2.5g CTAB（最终浓度为10％）
12毫升无核酸酶的H 2 O
最终体积：25ml
加热至55°C溶解
加水至最终体积为25 ml。然后是0.45μm，然后是0.22μm的滤色片

致谢

CLM由NIH培训授权5T32AI007172-34支持，该工作由R24 ODO19793，R01 OD011170，R01 AI111918和R01 DK101354资助。伯克维尔康康基金支持DSK。粪便粉碎方案适用于圣路易斯华盛顿大学的Jeffrey Gordon实验室慷慨提供的方案。 VLP方案从用于噬菌体分离的方案（Reyes等人，2013）中改编。我们要感谢布莱恩·凯勒博士，博士D对本手稿的批评性评论。

参考文献

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