材料和试剂

（例如，Fisher Scientific，目录号：S348903）
24孔细胞培养板（例如，Corning，Costar ^{，目录号：3527）}
移液管吸头10μl（TipOne）（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1110-3000）
移液器提示1 ml（Greiner Bio One International，目录号：740290）
移液器提示100μl（Greiner Bio One International，目录号：739290）
pcDNA3 （Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）
注意：来自Invitrogen的pcDNA3不再可用。或者，可以使用pcDNA3.1 ^（+）（Thermo Fisher Scientific，目录号：V79020）。
兔肾（RK13）细胞（兽医学报收集的RIE 109）
MEM Eagle（汉克盐和L-谷氨酰胺）（Sigma-Aldrich，目录号：M4642）
MEM（Earle's salts）（Thermo Fisher Scientific，目录号：61100061）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Carl Roth，目录号：6885.1）
NEA（非必需氨基酸）（Biochrom，目录号：K 0293）
丙酮酸钠（EMD Millipore，目录号：106619）
Tris-HCl（pH8.5）
胎牛血清（FBS）（Biowest，目录号：S181G）
Lipofectamine ^® 2000试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：11668027）
Opti-MEM ^®还原血清培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985062）
氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：9265.1）
氯化钾（KCl）（Carl Roth，目录号：5346.1）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D9434）
胰蛋白酶（1：250）粉末（Thermo Fisher Scientific，目录号：27250018）
乙二胺四乙酸（EDTA）（SERVA Electrophoresis，目录号：11280.01）
多聚甲醛（Carl Roth，目录号：0335.1）
10％成长媒体（见食谱）
3％多聚甲醛（见配方）
10 mM Tris HCl（pH 8.5）（见配方）
Alsever's-Trypsin Versen（ATV-）解决方案（见配方）

注意：解决方案和媒体＃6，11，14，15，16，21，22，23，24和26应保持在4°C。

设备

T75烧瓶（例如，Corning，目录号：430725U）
孵化器（例如松下，三洋，型号：MCO-19AIC或Fisher Scientific，目录号：12826756）
荧光显微镜（例如，Nikon Instruments，型号：Eclipse Ti-S）
超高压汞灯电源（例如，尼康仪器，型号：C-SCH1）
光源（例如，尼康Instruments，型号：LH-M100C-1）
Vortexer（例如，Fisher Scientific，目录号：S96461A）
层流罩（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Safe 2020 Class II，目录号：51026637）}
1.5ml管的离心机（例如，Eppendorf，型号：5415D）
移液器控制器（例如，，pipetboy acu 2，VWR，目录号：37001-856）
纳米光度计（例如，VWR，IMPLEN，型号：P330，目录号：CA11027-294）

软件

计算机运行软件NIS-Elements V 4.00.01（Nikon，Düsseldorf，Germany）

程序

质粒的制备
1. 用Tris-HCl pH8.5稀释表达推定的融合蛋白的质粒为200ng /μl（参见食谱）。包括表达自发荧光蛋白（例如，GFP或mCherry）的质粒作为标记以便于评估测定。这里，浓度为100ng /μl就足够了注意：我们用于实验的表达质粒是基于pcDNA3，一种具有组织型转基因表达的哺乳动物表达载体，在人巨细胞病毒即时早期启动子/增强子复合物和新霉素抗性pEGFP-N1作为标记的控制下以便于评估测定（Schröter等，2015）
细胞的制备
1. 在Eagle的最低必需培养基中补充10％FBS培养兔肾（RK13）细胞。将细胞用ATV（配方3）和种子〜1.8×10 5个细胞/孔胰蛋白酶消化至24孔细胞培养皿中。
2. 第二天使用细胞进行转染。细胞应具有80-90％的汇合度。
  注意：针对最佳转染效率的细胞融合因细胞类型而异。对于RK13和Vero细胞，建议80-90％的汇合
转染
1. 在单独的管中制备DNA混合物和Lipofectamine混合物。
2. 将脂质体混合物滴加到DNA混合物中，轻轻敲打溶液并在室温（RT）下孵育20分钟（视频1）。
  注意：重要的是轻轻混合，彻底混合以形成DNA-脂质复合物。
  
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  视频1.教程：如何将Lipofectamine混合物逐滴加入DNA混合物
  
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3. 从细胞中去除培养基，并将转染溶液逐滴加入细胞单层（视频2）。
  注意：为了允许转染溶液的相等分配，将其循环逐滴添加到单层上（视频2）。
  
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  视频2.教程：如何向细胞单层添加转染溶液
  
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4. 向细胞中加入另外200μl的Opti-MEM以防止细胞干燥。
5. 在37℃和5％CO 2下孵育细胞3小时。
6. 3小时后，从细胞中取出转染溶液，并向细胞中加入补充有2％FBS的新鲜MEM，并在37℃和5％CO 2下孵育18-24小时。有关整个过程的概述，请参见图1.
  注意：为了获得可比较的结果，在固定细胞之前，在每个实验中使用完全相同的孵育时间。
  
  图1.转染方法的示意图
固定
1. 准备3％的PFA（见食谱）。
2. 使用摇杆在室温下，用约1ml PBS清洗培养基并洗涤细胞单层2分钟
3. 取出PBS，每孔用200μl3％PFA固定细胞。在室温下固定细胞20分钟。
4. 每孔用1ml PBS洗涤2×细胞。
5. 每孔加入1 ml PBS，并将细胞储存在4°C。
融合活动的确定
注意：为了量化融合活性，使用Nikon Eclipse Ti-S荧光显微镜和Nikon NIS-Elements成像软件测量具有三个或更多核的绿色合成细胞的数量和面积。
1. 使用固定细胞通过荧光显微镜测定融合活性
2. 打开NIS-Elements成像软件（Nikon）并选择相应类型的荧光和物镜（例如，FITC，10x）（参见图2红色框）。
3. 选择测量手动测量区域（图2A，视频3）。
  注意：NIS-Elements支持的单位包括：像素，纳米，微米，毫米，厘米，分米，米，英寸和密耳。对于我们的测量，我们使用微米。
  
  图2. NIS Elements软件的示例视图。 A.选择手动测量; B.导出数据。
  注意：首先，测量屏幕右侧角落的合胞体积，因为每个合胞体都会在其右侧的站点上标有白色图标，这可能会妨碍右侧的合胞体的视图（参见图2B）。
4. 每次在10个视场（〜5.5 mm ²）中测量所有明显的合胞体，每次从相应图像的右上角开始。数据，包括每个合胞体的数量以及平均合胞体积将出现在右下角的表格中（见图2B绿色框，视频3）。
  
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  视频3.教程：如何使用NIS Elements软件测量合胞体系
  
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5. 通过单击导出选项按钮将数据直接导出到Excel文件或文本文件（参见图3红色框）。（选择是否将数据导出到Excel文件或文本文件。）您可以通过浏览按钮修改文件的名称和路径。
6. 在三个不同的日子重复整个实验至少三次，以计算相对融合活性和相应的标准偏差（SD）。

数据分析

为了计算每个样本的总融合活性，对应于给定的孔，将合胞体数与10个视野的平均合胞体面积相乘。
您计算了107个合胞体，平均合胞体积为7048μm，其融合活性为107×7,048.6 = 754,200.2。
通过比较三个独立实验中的每一个估计的融合活动，计算每个样本的总融合活性的标准偏差（SD）。
通过将其总融合活性与阳性对照（例如野生型gB，gH和gL）进行比较来确定不同样品的相对融合活性，其应当设定为100％。 br /> 例如，如果阳性对照的总融合活性为754,200.2，测试样品的融合活性为431,708.6，则测试样品的相对融合活性为（100/754,200.2）×431,708.6 = 57％（图3）注意：使用Excel/Prism或类似的工具来促进计算和创建图形。
代表数据

图3.融合活性为了测试融合活性，用编码野生型gB或突变型gB，gH，gL和gD以及EGFP的表达质粒共转染RK13细胞以促进测定通过荧光显微镜。用野生型gB与野生型gH，gL和gD组合的质粒进行测定为100％。用空载体pcDNA3作为阴性对照。转染后一天，测量含有三个或更多核的细胞的面积，并乘以合胞体数以确定融合活性。计算三个独立测定的相应标准偏差。

食谱

10％生长培养基（1L），pH7.2
以下试剂应溶于双蒸水中至最终体积为1升：
5.32克MEM鹰（汉克盐）
4.76克MEM（厄尔盐）
1.25g NaHCO 3
10 ml NEA
120毫克丙酮酸钠
10mM Tris-HCl，pH8.5
准备2 M储备溶液（500 ml）：
121.14克Tris HCl
用〜50 ml发烟HCl调节pH至8.5 稀释储备液1:20与ddH 2 O
阿尔卑斯胰蛋白酶维生素（ATV-）溶液，pH 7.2
8.5克NaCl
0.4克KCl
1.0克右旋糖
0.58g NaHCO 3
0.5g胰蛋白酶1：250
0.2g EDTA
Ad 1 L ddH 2 O
3％PFA（100 ml）
3克多聚甲醛
100毫升PBS
让PFA在65°C溶解

致谢

该协议是从以前的研究（Schroter等人，2015）中进行了修改和修改的。这项工作得到了DFG（ME 854/11）的资助。

参考文献

Harrison，SC（2015）。病毒膜融合 病毒学 479-480：498-507。
Turner，A.，Bruun，B.，Minson，T.and Browne，H。（1998）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9420303"target ="_ blank"> 1型单纯疱疹病毒的糖蛋白gB，gD和gHgL是必需的，足以介导Cos细胞转染系统中的膜融合。 em> 72（1）：873-875。
Muggeridge，MI（2000）。细胞表征在转染细胞中由单纯疱疹病毒2糖蛋白gB，gD，gH和gL介导的融合。 Gen Virol 81（Pt 8）：2017-2027。
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Schröter，C.，Vallbracht，M.，Altenschmidt，J.，Kargoll，S.，Fuchs，W.，Klupp，BG and Mettenleiter，TC（2015）。< a class ="ke-insertfile"href = http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26656712"target ="_ blank">伪狂犬病病毒糖蛋白gB，gD和gH的突变功能上补偿gL的缺失。 J Virol 90（5）：2264-2272。