材料和试剂

注意：这里描述的协议基于最近出版的RNA引导的Cas9系统（ Yan et al。，2016 ）。只有经典的克隆方法，如限制性内切酶消化和内聚端连接才能构建准备进行植物转化的质粒。

消耗品

200μlPCR管（Kisker Biotech，目录号：G003-SF）
或96孔PCR板（SARSTEDT，目录号：72.1978.202）
StarSeal密封带（STARLAB，目录号：E2796-9793）
1.5ml反应管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
移液器提示
Scalpel
圆形9.21厘米（SARSTEDT，目录号：82.1472.001）
培养皿，方形，10 x 10 x 2厘米（SARSTEDT，目录号：82.9923.422）
用于电穿孔的比色皿，例如，Gene Pulser 比色杯0.1cm（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652089）
5毫升玻璃移液器
Micropore ^TM磁带（VWR，目录号：115-8172）
注意：可以使用任何适当的耗材。

主管单元格

（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：C4040）}
电生物根癌土壤杆菌，菌株pGV3101（用于制备电抗病毒农杆菌，请参见Mersereau等人，1990）

植物材料

拟南芥 Col-0

质粒

AtU6-26-V4（3.5 kb，氨苄青霉素抗性标记[AmpR]，可根据要求提供）
UBQ10 :: pcoCas9p1300（14.3 kb，卡那霉素抗性标记[KanR]在植物中的细菌，潮霉素或卡那霉素抗性标记[HygR或KanR]可根据要求提供）
可选：pGEM ^® -T easy（Promega，目录号：A3600）

酶和缓冲液
限制
1. Bpi I（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：ER1011）
2. I-HF（New England Biolabs，目录号：R3142）
3. Xba I（New England Biolabs，目录号：R0145）
4. I-HF（New England Biolabs，目录号：R3133）
5. I-HF（New England Biolabs，目录号：R3642）
6. Cutsmart ^{®缓冲液（New England Biolabs，目录号：B7204S，随酶提供）}
连接
1. T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202）
2. T4 DNA连接酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0202S，用酶提供）
基因分型（细菌）

绿色Taq DNA聚合酶（GenScript，目录号：E00043）
缓冲区（GenScript，目录号：B0005，随酶提供）
10mM dNTP（Carl Roth，目录号：K039）
任何DNA加载染料，例如6倍凝胶加载染料，紫色（New England Biolabs，目录号：B7024）
任何DNA大小的标准，例如，GeneRuler TM 1 kb Plus DNA梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：SM1331 ）}
琼脂糖（Carl Roth，目录号：3810）
10x TBE电泳缓冲液（见配方）
Tris（Applichem，目录号：A1379）
硼酸（Applichem，目录号：131015）
EDTA（Applichem，目录号：131669）

去离子水（无菌）
抗生素（-20°C储存库存）

氨苄青霉素（Carl Roth，目录号：K029，在去离子水中储存50mg/ml）
卡那霉素（Carl Roth，目录号：T832，去离子水中30mg/ml）
利福平（申请，目录号：A2220，在DMSO中25mg/ml）
庆大霉素（Carl Roth，目录号：0233，去离子水中为10毫克/毫升）
潮霉素（Carl Roth，目录号：CP13，在去离子水中储存10毫克/毫升）

媒体（见食谱）

的YEB培养基肉提取物（Carl Roth，目录号：5770）
酵母提取物（Carl Roth，目录号：2904）
胨（Sigma-Aldrich，目录号：82303）
蔗糖（Carl Roth，目录号：4621）
硫酸镁（MgSO 4）（Carl Roth，目录号：P027）
Bacto-agar（Th。Geyer，CHEMSOLUTE ^®，目录号：9914-500G）
氢氧化钠（NaOH）（Merck，目录号：28245）
YT培养基。大肠杆菌
氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：9265）
酵母提取物（Carl Roth，目录号：2904）
胨（Sigma-Aldrich，目录号：82303）
Bacto-agar（Th。Geyer，CHEMSOLUTE ^®，目录号：9914-500G）
氢氧化钠（NaOH）（Merck，目录号：28245）
MS + B5维生素（Duchefa Biochemie，目录号：M0231）
氢氧化钾（KOH）（Merck Millipore，目录号：105033）

DNA纯化

凝胶纯化，例如，NucleoSpin凝胶和PCR清除（MACHEREY-NAGEL，目录号：740609）
质粒分离，例如NucleoSpin质粒EasyPure（MACHEREY-NAGEL，目录号：740727）

Silwet L-77（Lehle种子，目录号：VIS-30）用于植物转化
漂白剂（Carl Roth，目录号：9062）
37％HCl（Merck Millipore，目录号：100317）
基因分型（植物）

可选：Phire Plant Direct PCR Kit（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：F-130WH）}
可选：T7内切核酸酶I（New England Biolabs，目录号：M0302）加上NEBuffer 2（New England Biolabs，目录号：B7002），250mM EDTA
可选：pGEM ^® -T easy（Promega，目录号：A3600）

寡核苷酸（5'-3'），10pmol/μl

M13F_TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R_CAGGAAACAGCTATGACC
K197 _CTGTTAATCAGAAAAACTCAG

设备

注意：不需要特定的设备。可以使用任何适当的设备。

带互联网接入的电脑
热循环仪（例如，Eppendorf，型号：Mastercycler nexus）
Thermoblock（例如，Eppendorf，型号：Thermomixer ^®舒适）
板培养箱（28℃，37℃）
振荡器（28°C，37°C）
水平凝胶电泳系统（例如，Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-Sub Cell GT System）
紫外线透照仪（例如，Bio-Rad Laboratories，型号：GelDoc TM） XR +系统）
电生理器（例如，Bio-Rad Laboratories，型号：MicroPulser ^TM Electroporator）
10 L干燥器
通风柜
200毫升烧杯

程序

使用CRISPR-PLANT制备gRNA-间隔物（Xie等人，2014）和引物设计（图1I）

转到 http://www.genome.arizona.edu/crispr/index.html 。
选择"搜索"。
选择"选择物种"，然后选择"拟南芥拟南芥"
选择'染色体'，并在'From'和'To'中输入目标区域的坐标。
用"按地区搜索"确认。
您将返回Class 0.0和Class 1.0 gRNAs。 0.0类gRNA应该更具体。 SeqID是您预定义区域中gRNA的坐标。 minMM_GG（和minMM_AG）值是指与PAM基序相邻的12bp序列具有与A中任何其它序列的最小错配量。 thaliana 基因组。价值越高，违规定位风险就越小。因此，应考虑minMM_GG高于3的序列。
复制最佳的20 bp长间隔序列。这里，X表示任何核苷酸转发顺序：5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
反向顺序：5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
当U6 启动子驱动gRNA的表达时，转录起始需要鸟嘌呤（G）作为转录起始位点。如果所选择的间隔序列不以"G"开头，则更改第一个基座。这对Cas9的特异性没有太大的影响，因为特异性主要取决于邻近PAM基序的12 bp。
转发顺序：5'-GXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
反向顺序：5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXC-3'
将"GATT"和"AAAC"分别添加到正向和反向序列的5'端，以产生与I/O兼容的突出端。正向引物：5'-GATTGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
反向引物：5'-AAACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXC-3'
现在你有一个互补的引物对可以订购。

gRNA引物退火（图1II）

混合10μl每个引物（10pmol/μl）。变性引物在98℃下3分钟。通过将温度从98℃降低到22℃来将引物杂交到热循环仪中。暂停每个学位30秒。

根据制造商的说明书（图1III），将AU6-26-V4-矢量与

将消化物与DNA负载染料混合，并将其装载在1％琼脂糖凝胶上。通过凝胶电泳分离消化未消化的条带
从凝胶中纯化线性载体骨架（3,517bp）

在10μl连接反应（图1IV）中，对已退火的gRNA引物和Ipi6消化的AtU6-26-V4载体进行退火（图1IV）。

混合25ng至50ng载体，1μl10×T4 DNA连接酶反应缓冲液和0.5μlT4 DNA连接酶（200U）。用混合的底漆填充剩余的体积。
在室温下孵育反应10分钟。
注意：如果在步骤6中遇到阳性转化体遇到问题，请使用4°C过夜孵化。

使用3μl连接反应来转化化学感受态的TOP10E。大肠杆菌细胞。

在冰上解冻50μl感受态细胞。
向细胞中加入3μl连接反应。
在冰上孵育15分钟。
在42℃，热电冲击细胞45秒，并放置在冰上2分钟
加入400μlYT培养基，并在37℃和750 rpm下将细胞孵化60分钟。
在含有50μg/ml氨苄青霉素（YT-amp）的固体YT培养基上将板60至80μl转化。

做一个菌落PCR来转基因。通常测试5至10个菌落足以获得阳性转化体
1. 如下设置每个菌落20μlPCR反应。最终浓度用括号表示：
  2μl10×Taq缓冲液（1x）
  0.6μlM13F（0.5μM）
  0.6μlgRNA特异性反向引物（0.5μM）
  0.4μldNTPs（0.2 mM）
  0.1μl绿色Taq DNA聚合酶（0.5U）
  16.3微升去离子水
2. 使用移液器吸头挑取菌落并将细胞重新排列在YT放大器板上。直接将尖端浸入PCR反应中以转移少量细胞。在37℃下孵育板约5小时，并使用以下条件在热循环仪中运行PCR：
  
  注意：退火温度取决于gRNA特异性反向引物。 M13F在退火过程中在54°C至60°C的范围内工作良好。代替M13F和gRNA特异性反向引物，您还可以使用M13R和gRNA特异性正向引物，延伸时间为20秒。
3. 向反应中加入4μl6x DNA负载染料，并将其加载到1％琼脂糖凝胶上。使用M13F和gRNA特异性反向引物的PCR反应的预期扩增子大小为581bp，与M13R和gRNA特异性正向引物的反应为257bp。
4. 准备3毫升YT-amp，并从修复板中挑选PCR阳性克隆。在37°C下以190 rpm的速度孵育过夜。
5. 从阳性克隆中分离质粒，并使用M13R作为测序引物，通过Sanger测序检查正确的插入。
可选（用于复用）：
如果需要多于一种的gRNA，首先在单独的AtU6-26-V4载体（gRNA1-AtU6-26-V4，gRNA2-AtU6-26-V4，等等）中制备每个gRNA，并且将它们组合成单个gRNA2-gRNA1-AtU6-26-V4载体。
1. 用gp1-AtU6-26-V4切割用Kpn I-HF和I-HF（3,519bp，图1V）打开。
2. 使用Kpn I-HF和Xba I（643bp，图1VI）从gRNA2-AtU6-26-V4切割gRNA2。
3. 凝胶上加载反应，凝胶纯化阳性条带
4. I-gRNA1-AtU6-26-V4-Kpn I-gRNA2-Xb I I gRNA2-I-gRNA1-AtU6-26-V4-Kpn I （ Xba I和 Spe 我产生兼容的目的，图1VII）。
5. 转换TOP10 E。大肠杆菌细胞，在YT-amp板上选择转化体
6. 具有M13F的基因型克隆和最后添加的gRNA的特异性反向引物（扩增子大小= 581bp）。
7. 分离质粒和序列与M13R。
  重复此步骤以添加更多gRNA。
根据制造商的说明书，将具有kpn I-HF和Sbf I-HF的gRNA2-gRNA1-AtU6-26-V4消化。通过此步骤，您将切除包含U6启动子的gRNA2-gRNA1单位（图1VIII）。
1. 将消化物与DNA负载染料混合，并将其装载在1％琼脂糖凝胶上。通过凝胶电泳分离消化未消化的条带
2. 从凝胶中纯化gRNA片段（单个gRNA片段的660bp，双gRNA片段的1,287bp）。
根据制造商的说明书，将UBQ10 :: pcoCas9p1300与 Kpn I-HF和Sbf I-HF进行消化以打开载体（图1IX）。
1. 将消化物与DNA负载染料混合并将其装载到1％琼脂糖凝胶上。通过凝胶电泳分离消化未消化的条带
2. 从凝胶纯化线性化载体骨架（14.3 kb）
在20μl反应中调节gRNA2-gRNA1单位和UBQ10 :: pcoCas9p1300（图1X）。
1. 分别混合25ng至50ng载体，10ng至20ng gRNA2-gRNA1，2μl10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，去离子水，19μl和1μlT4 DNA连接酶（400U）。
2. 在4℃下反应过夜，
使用3μl连接反应来转化化学感受态的TOP10E。大肠杆菌细胞。用30μg/ml卡那霉素选择YT平板上的转化体
按照步骤6所述进行菌落PCR以转基因转基因
1. 具有K197的基因型克隆和第一次加入的gRNA的特异性正向引物（这里是gRNA1，产品大小为801bp）。
2. 分离和序列质粒与M13F（可选与K197）
使用50ng AtU6 :: gRNA2-AtU6 :: gRNA1-UBQ10 :: pcoCas9p1300转化A。根癌土壤杆菌通过电穿孔
1. 解冻50μl有效的。冰川上的根癌土壤杆菌
2. 在冰上预先冷却比色皿。
3. 将50ng最终向量添加到 A。根癌土壤杆菌细胞，转移到比色杯并将比色皿置于电穿孔器中。
4. 选择MicroPulser ^TM电穿孔仪（Bio-Rad，2.2 kV的1个脉冲）或等效设置的"Agr"设置，以转换细胞。
5. 加入1ml YEB培养基并转移到新鲜的1.5ml反应管中。在28℃和750rpm下孵育2至3小时。
6. 将板60μl进行转化，并在28℃下，在30℃/30μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平和25μg/ml庆大霉素的YEB培养基上选择2天。
使用转换的 A。 tumefaciens 转换 A。 thaliana 通过浸润浸润（Clough and Bent，1998; Chen，2011）
通过气相灭菌灭菌种子，例如。
1. 将种子转移到1.5ml反应管中
2. 将通风管上的10L干燥器放开管。
3. 将装有100ml漂白剂（6％）的200ml烧杯放入干燥器中
4. 使用玻璃移液管向漂白剂中加入3ml HCl（37％），并快速关闭干燥器盖。
  注意：仔细：蒸汽可以化学地烧伤皮肤和眼睛！
5. 具有M13F的基因型克隆和最后添加的gRNA的特异性反向引物（扩增子大小= 581bp）。
6. 分离质粒和序列与M13R。
  重复此步骤以添加更多gRNA。
根据制造商的说明书，将具有kpn I-HF和Sbf I-HF的gRNA2-gRNA1-AtU6-26-V4消化。通过此步骤，您将切除包含U6启动子的gRNA2-gRNA1单位（图1VIII）。
1. 将消化物与DNA负载染料混合，并将其装载在1％琼脂糖凝胶上。通过凝胶电泳分离消化未消化的条带
2. 从凝胶中纯化gRNA片段（单个gRNA片段的660bp，双gRNA片段的1,287bp）。
根据制造商的说明书，将UBQ10 :: pcoCas9p1300与 Kpn I-HF和Sbf I-HF进行消化以打开载体（图1IX）。
1. 将消化物与DNA负载染料混合并将其装载到1％琼脂糖凝胶上。通过凝胶电泳分离消化未消化的条带
2. 从凝胶纯化线性化载体骨架（14.3 kb）
在20μl反应中调节gRNA2-gRNA1单位和UBQ10 :: pcoCas9p1300（图1X）。
1. 分别混合25ng至50ng载体，10ng至20ng gRNA2-gRNA1，2μl10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，去离子水，19μl和1μlT4 DNA连接酶（400U）。
2. 在4℃下反应过夜，
使用3μl连接反应来转化化学感受态的TOP10E。大肠杆菌细胞。用30μg/ml卡那霉素选择YT平板上的转化体
按照步骤6所述进行菌落PCR以转基因转基因
1. 具有K197的基因型克隆和第一次加入的gRNA的特异性正向引物（这里是gRNA1，产品大小为801bp）。
2. 分离和序列质粒与M13F（可选与K197）
使用50ng AtU6 :: gRNA2-AtU6 :: gRNA1-UBQ10 :: pcoCas9p1300转化A。根癌土壤杆菌通过电穿孔
1. 解冻50μl有效的。冰川上的根癌土壤杆菌
2. 在冰上预先冷却比色皿。
3. 将50ng最终向量添加到 A。根癌土壤杆菌细胞，转移到比色杯并将比色皿置于电穿孔器中。
4. 选择MicroPulser ^TM电穿孔仪（Bio-Rad，2.2 kV的1个脉冲）或等效设置的"Agr"设置，以转换细胞。
5. 加入1ml YEB培养基并转移到新鲜的1.5ml反应管中。在28℃和750rpm下孵育2至3小时。
6. 将板60μl进行转化，并在28℃下，在30℃/30μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平和25μg/ml庆大霉素的YEB培养基上选择2天。
使用转换的 A。 tumefaciens 转换 A。 thaliana 通过浸润浸润（Clough and Bent，1998; Chen，2011）
通过气相灭菌灭菌种子，例如。
1. 将种子转移到1.5ml反应管中
2. 将通风管上的10L干燥器放开管。
3. 将装有100ml漂白剂（6％）的200ml烧杯放入干燥器中
4. 使用玻璃移液管向漂白剂中加入3ml HCl（37％），并快速关闭干燥器盖。
  注意：仔细：蒸汽可以化学地烧伤皮肤和眼睛！
5. 灭菌3至4小时。
用20微克/毫升潮霉素或卡那霉素（取决于您选择的UBQ10 :: pcoCas9p1300的抗性标记），在1/2 MS上播种种子以选择阳性转化体。使用Micropore ^TM胶带的密封板。在黑暗中将种子在4℃下分层3天。在长的天气条件下（22°C，16：8 h光：暗光周期）发芽种子，直到转化株达到4个真叶期。移植幼苗到土壤，并在长的日子条件下继续生长
基因型转化体。
如在T1代，Cas9酶的活性和效率以及DNA修复机制的活性可能因细胞而异，每种植物最有可能是不同基因型的镶嵌。因此，我们建议汇集一个植物的基因分型样品，如来自不同分支的花生叶片。如果在T1中鉴定出具有预期突变的植物，则可以对单个分枝标记和基因型，因为它们可以具有不同的基因型（图2C和2D）。基因分型的方法取决于预期的结果

由多个gRNA产生的大片段缺失可以通过PCR鉴定，然后通过PCR产物的凝胶电泳鉴定（图2A和2B）。
注意：在每个gRNA靶位点约200bp到400bp的距离内设计预期缺失侧翼的引物。对于高通量基因分型，我们建议使用Phire Plant Direct PCR Kit制备10μlPCR反应。

图2.检测AP1 基因座中的大片段缺失。 A.使用两种不同的gRNA（剪刀）对AP1 基因座进行靶向。目标网站是AP1 的第三和第六内含子中的序列。 B.在T1代中表型野生型（WT）和类似于（a）的分支的基因分型显示在AP1基因座中存在680bp缺失在 ap1 样分支（m）中。 C和D. T1代植物可以是不同基因型的马赛克。在同一植物的两个不同分支上可以发现两种不同的花表型，即野生型（C，左; D，蓝色箭头）和 ap1 （C，右; D，黄色箭头）。 />
通过T7核酸内切酶消化（Vouillot et al。，2015）可以检测到产生与野生型等位基因2 bp的最小错配的小缺失或多态性。

执行基因分型PCR，如提及大片段缺失。

通过向PCR产物中加入1.12μlNEBuffer 2而不纯化DNA来设置杂交反应。分别准备WT控制和样品。当在T1中合并不同的分支时，不需要向样品中添加野生型PCR产物，因为我们通常不会期望Cas9效率高于T7内切核酸酶检测限（Vouillot等人， 2015）。但是，如果您在单分支基因分型时已经看到了明确的表型，您可以用野生型取代20％的样本量，以免遗漏纯合突变体分支。

使用以下条件杂交PCR产物：

加入0.1μlT7内切核酸酶（1U），37℃孵育30分钟

用0.8μl250 mM EDTA停止反应

在2％琼脂糖凝胶上分离切割产物
T7内切核酸酶消化不能有效地检测到点突变（Vouillot等，2015）和IDT Surveyor 核酸酶（Integrated DNA Technologies ）被认为是切点突变，似乎与Phire Plant Direct PCR Mix不相容。考虑到高产量突变体筛选的经济因素，超出制造商的建议，我们没有增加Surveyor ^®酶的量。在这里，我们建议使用T7内切核酸酶测定法排除具有2 bp或更高突变的植物。然后将其余样品的PCR产物纯化并送至Sanger测序

通过测序确认突变。
从具有突变的分支中收获种子。
播种种子以产生约100人的小T2群体。选择携带突变但丢失T-DNA的植物。

为了鉴定仍携带转基因的植物，使用M13F和gRNA特异性反向引物（产品大小557bp）。排除PCR阳性植物
针对预期突变的基因型，如步骤17所述注意：为了验证T2中的小片段缺失（图3），在杂交前准备WT，样品和WT和样品的1：1混合物。 WT样品混合物是必需的，因为植物对于突变体等位基因可以是纯合的。在这种情况下，它们在杂交时不产生异源双链DNA，不会被T7内切核酸酶消化。

图3.通过T7消化检测小缺失或多态性 T2野生型（WT），突变体（m）和野生型和突变体（WT + m）的1:1混合物的PCR样品杂交。反应体积的一半在没有T7内切核酸酶（未消化）的情况下孵育，另一半与1U酶（T7消化物）一起孵育，并通过在2％琼脂糖上的凝胶电泳分离。突变样品中切割产物的存在是至少两种不同等位基因的结果，其可以是野生型和突变体或不同突变体等位基因或两种选择的混合物。由于向突变体样品（WT + m）添加野生型不会稀释切割产物的信号，所以很可能是不同的突变体等位基因，其后来通过测序证实（未显示）。星号表示未消化的PCR产物，黑色箭头指出裂解产物。 GR表示GeneRuler ^TM 1 kb Plus DNA梯。
注意：协议设置完成后，可以省略"未消息"控件。

数据分析

在T1代中获得的突变可以通过步骤17所述的Sanger测序来确认。但是，由于相邻细胞可能具有不同的突变，并且由于突变可能是双重的，因此我们建议将突变型PCR产物凝胶纯化并将其亚克隆到pGEM或其他任何克隆载体。序列5至10个阳性菌落，以获得获得突变的概述。在T2代中选择无T-DNA的突变植物（步骤19），通过测序再次确认突变的存在和类型。
注意：由Phire Plant Direct PCR Kit产生的PCR产物是平端的，并且在连接pGEM -T之前需要A-tailing。

笔记

这个协议很简单直接。到目前为止，我们的组已经产生了含有不同组gRNA的50多个二元载体，并用于拟南芥的基因组编辑。

食谱

10倍TBE电泳缓冲液（1升）
1 M Tris
1 M硼酸
0.02 M EDTA
去离子水广告1,000 ml
用去离子水稀释10倍TBE缓冲液至1:10，用作凝胶运行缓冲液
（1L）
的YEB培养基 5克牛肉提取物
1克酵母提取物
5克蛋白胨
5克蔗糖
500mg MgSO 4
10克Bacto-agar
去离子水广告1,000 ml
使用NaOH调节pH至7.0 高压灭菌器在121°C和2 bar 15分钟的YEB培养基
YT培养基。大肠杆菌（1L）
5克NaCl
5克酵母提取物
8克蛋白胨
（15克Bacto-agar）
去离子水广告1,000 ml
使用NaOH调节pH至7.0 高压灭菌YT培养基在121°C和2 bar 15分钟
（1 L）
2.3克MS + B5维生素
8 g Phyto-agar
去离子水广告1,000 ml
使用KOH调节pH至5.7 高压灭菌½MS在121°C和2 bar 15分钟
准备无菌50％蔗糖（单独过滤灭菌或高压釜）
在浇注板之前，加入1％蔗糖至1/2 MS 注意：不需要加入蔗糖。优势在于选择性培养基上的幼苗恢复得更好。缺点是它可以促进培养基上的真菌生长。

致谢

这个协议是基于我们以前在Plant Methods中发表的工作（ Yan 等。，2016 ）。 J.S.的工作得到IMPRS-PMPG奖学金的支持。公司感谢Alexander-von-Humboldt基金会和BMBF的支持。作者宣称他们没有竞争的利益。

参考文献

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Li，JF，Norville，JE，Aach，J.，McCormack，M.，Zhang，D.，Bush，J.，Church，GM and Sheen，J.（2013）。拟南芥中的多重和同源重组介导的基因组编辑和Nicotiana本指南使用指南RNA和Cas9。生物技术 31（8）：688-691。
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