材料和试剂

Miracloth（EMD Millipore，目录号：475855-1R）
培养皿（Golias，目录号：PE01K）
寄主植物（hop Hum ulus ulus ulus ulus ulus ulus>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
真菌分生孢子（非苜蓿轮枝孢霉属）;致死性病原型PV1 [分离株T2]）（Radisek等人，2006）
肥料YaraKristalon黄色NPK 13-40-13 + ME [微量元素：B - 0.025％; Cu * - 0.01％; Fe * - 0.07％; Mn * -0.04％; Mo - 0.004％; Zn * -0.025％; * - 螯合基地（Yara International ASA）
肥料YaraKristalon特殊NPK 18-18-18 + ME [ME - 微量元素：B - 0.025％; Cu * - 0.01％; Fe * - 0.07％; Mn * -0.04％; Mo - 0.004％; Zn * -0.025％; * - 螯合基地（Yara International ASA）
生长媒介

对于真菌接种物制剂：液体GFM-通用真菌培养基（Kayser，1992）（参见食谱）
对于植物：土壤底物（生长植物的土壤底物）
对于真菌重新分离：马铃薯葡萄糖琼脂+抗生素（硫酸链霉素，新霉素，氯霉素;每100毫克/毫升）= PDA + A板（参见食谱）

无菌蒸馏水（IDT，目录号：231-791-5）
96％乙醇
蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：73049-73-7）
酵母提取物（AMRESCO，目录号：J850）
葡萄糖（Kemika，目录号：07051）
硝酸钾（KNO 3）（EMD Millipore，目录号：105063）
马铃薯葡萄糖琼脂（Biolife，目录号：4019352）
硫酸链霉素（Duchefa Biochemie，目录号：S0148）
新霉素（Duchefa Biochemie，目录号：M0135）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）

设备

500毫升锥形瓶（BRAND，目录号：92824）
2升塑料杯（BRAND，目录号：87822）
塑料壶0.5升
旋转振动筛（Infrost，目录号：29313）
生长室（Kambič实验室设备，型号：RK-13300）
荧光灯（Idealo，型号：Osram Fluora L 58 W/77）
Thoma计数室（BRAND，Wertheim，Germany）
木棍用于跳跳的支持
手镯和镊子
光学显微镜（Nikon Instruments）

程序

宿主植物的制备
1. 对于接种，使用两个月大的，根植于0.5L塑料盆栽植物的植物，并在温室中从啤酒花母植物中生长为软木屑。植物应由专业种植者直接生产。
2. 在温室里种植植物在雾台上。每2天浇灌一次植物，每周施肥一次，使用含有微量和微量元素（例如，0.1％YaraKristalon黄NPK 13-40-13 + ME的溶液）的叶面肥料。
3. 为了保持适当的健康状况，每周喷洒一次植物以防止害虫和叶面病害使用防护植物保护产品。
4. 使用敏感品种'Celeia'。
接种物准备
1. 在装有250ml液体GFM的四个500ml锥形瓶中的每一个中，将一小片真菌菌丝体（尺寸为2mm的球）从储备的PDA板（其应该保持在冰箱中）放置在补充有100mg/ml硫酸链霉素和100mg/ml氯霉素。
2. 在室温下和黑暗中将振荡器置于旋转振荡器上，在100rpm下孵育约5天（将振荡器置于暗室中）（图1）。
  
  图1：5天后生长的真菌培养物的图片。可以看到白色真菌菌丝体。具有产生大量孢子的真菌分离物的培养基变钝。
3. 通过过滤菌丝体和孢子通过miracloth（典型孔径为22-25μm）准备分生孢子接种物（孢子大小5至7μm）：
4. 使用Thoma计数室确定孢子浓度。确定一个过滤悬浮液的四次孢子浓度，并计算平均值
5. 用无菌蒸馏水将孢子浓度调至5×10 6 /分钟/ml。
6. 用于人造感染的浓度为5×10 -6 /分钟/ml的接种物的最终体积应为1μL。每一次接种量最多使用12株植物。
人造感染
1. 在0.5L塑料罐中种植的根系播种植物。用手尽可能多地使用土壤基底。
2. 用无菌水冲洗根部（只需轻轻浸泡几秒钟）。
3. 然后将根浸入1升接种物中10分钟，倒入2升塑料杯中。
4. 每次治疗至少接种10株植物。
5. 高压灭菌后处理剩余的真菌接种物。
6. 对照对照植物相似，但将根浸入无菌水中10分钟
7. 将植物放在大小为0.5升的新盆中。
8. 在生长室（RK-13300，Kambič）中，在温度为22℃，相对湿度为65℃的12小时荧光光照（L 58 W/77; Fluora，Osram）下生长植物作为单一生物光照期间为20％，暗期为70％。在室内生长期间，每周两次水（每周一和周五），每周施肥一次，使用含较高氮含量的叶面肥（例如，0.2％的YaraKristalon特殊NPK 18- 18-18 + ME）。
症状监测
1. 第一种疾病症状发生在接种后约20天（dpi）。第一个症状可以看作是一些叶子的淡黄色（图2 - 第1节）。当时没有观察到萎靡。
  
  图2.用于评估跳叶枯萎病叶片症状的0-5标度 0表示无叶症状，1 = 1〜20％叶面积枯萎，2 = 21〜40％的叶面积枯萎，3 = 41〜60％叶面积枯萎，4 = 61〜80％叶面积枯萎，5 = 81〜100％叶面枯萎。
2. 随后，以7天的时间间隔使用0-5量表（Radisek等人，2003）（图2）视觉评估植物的叶面症状。
3. 有3到5个评估时间点。在最后一个时间点拍摄植物，当时疾病症状最严重。在较早的时间点拍摄并不表明真菌接种和模拟接种植物之间的最大差异
4. 在视觉疾病评估结束时，进行病原体的真菌学重新分离，以确认接种植物中病原体的存在。
  1. 在地面切割植物并将其转移到层流。用96％乙醇喷洒切割的茎，并将其放在明火上，以便对表面进行灭菌。
  2. 通过使用从接种植物的茎无菌收获的木质部切片进行重新分离，并放置在PDA + A板上。
  3. 木质部实际上是茎的整个内部，它应该被切成1-2厘米长的碎片。在PDA + A板上放置三至六块植物。
  4. 在板在24℃的黑暗中孵育3-5天后，可以检测到真菌生长。检查出现的菌丝体（如果有）通过光学显微镜检查
5. 只有受感染的植物才能被考虑并用于进一步分析。
6. 计算每个植物每个时间点的疾病严重度指数（DSI），并确定平均疾病严重程度指数（方程式1）。也可以图形地显示DSI结果（图3）公式1：
  平均疾病严重程度指数=感染植物对最近评估时间点/受感染植物数量的评估总和（Jakse等人，2013）。
  
  图3. DSI指数的图形呈现示例感染野生型和两种V突变体的啤酒花植株的DSI曲线。恶性疟原虫，其毒力有所减弱，表现在五个不同时间点受感染植物的症状评估。
7. 疾病进展曲线（AUDPC）下的面积按照Campbell和Madden（1990）（等式2）所示计算，并以相对的AUDPC-rAUDPC（Simko和Piepho，2012）表示（公式3）。
  公式2：
  
  哪里，
  n =观察总数，
  y =每个植物的DSI指数，
  t =接种天数。
  
  公式3：
  rAUDPC =实际AUDPC值/最大潜在AUDPC值

数据分析

图4显示了致病性测定结果的代表性实例

图4.致病性测定结果 A.啤酒花植物的疾病症状左侧是模拟接种的无症状植物，正确的是用野生型感染的啤酒花植物的疾病症状。植物在接种31天后成像。 B.一个感染啤酒花植物的真菌学重新分离。在室温下在PDA + A板上铺板木质部切片后3天显示真菌生长。白色，蓬松的菌丝体是典型的V。 nonalfalfae 。然而，一些其它内生真菌的生长也可以出现，正如在第一行中的第一木质部部分清楚地看到的，并且在较小程度上与第二行中的第一和第二木质部部分相似。其他微生物也可能由木质部产生（见注释）。 V。非苜蓿科菌株优选在植物材料上生长（木质部分被菌丝体完全长满），而不是在PDA培养基上生长。

统计分析
按照以下顺序对rAUDPC值进行致病性测定结果的统计分析：

首先，使用Levene的测试者来评估方差值的差异。
其次，如果治疗rAUDPC值的差异没有显着性差异，则将每个治疗计算的受试者rAUDPC值与标准单因素方差分析随后进行Dunnett检验，其将突变感染植物的平均rAUDPC值与平均rAUDPC野生型感染植物的价值。
然而，如果处理rAUDPC值的差异存在显着差异，则应使用非参数统计分析的Kruskal-Wallis检验，比较rAUDPC值的等级。
如果存在差异，请执行Dunn的测试，以便将突变体感染植物的平均等级值与野生型感染植物的平均等级值进行比较。
结果以点图形式显示（图5）

图5. rAUDPC值的图形显示示例。提供了具有受损的毒力的野生型和两种突变体的平均rAUDPC值。星号显示出显着差异（*** P <0.001; ** <0.01）。误差条表示平均值的标准误差。

笔记

如"程序"一节（部分"B.接种物制备"，步骤6）中所述，每一个体积的接种物（其浓度为5×10 6）的最大12株植物分生孢子/ml）。在这些植物的根浸时，接种物被稀释。如果有更多的植物接种相同的接种物，则必须通过加入新鲜的分生孢子将所用接种物的浓度回收至5×10 6分配孢子/ml。更好地准备浓度为5×10 6 /分钟/ml的新接种物。
关于疾病症状评估，我们强烈建议同一人总是评估疾病症状。因此评估的任何错误都会较小，或至少相等于所有评估。
关于真菌学重新分离：虽然重新分离培养基含有300mg/ml的抗生素，并且在无菌环境中进行再分离，但是在培养基上铺板木质部之后会出现许多不同的微生物。室温下培养板应不超过5天。
必须使用光学显微镜对再隔离板上的新生菌丝进行形态学分析，以确认V的存在。 nonalfalfae 。 V的空气菌丝体非苜蓿通常是丰富的，絮状的，细菌的，菌丝是光滑的，宽1.5-3μm。分生孢子梗是直立或倾斜的，通常是确定的，分枝的或不分枝的，在整个殖民地和透明质素中不连贯地形成。

食谱

GFM
2克蛋白胨
2克酵母提取物
20 g葡萄糖 1 g KNO <3>
在1000毫升蒸馏水中混合，121℃高压灭菌20分钟
PDA用300毫克/毫升抗生素

在1000 ml蒸馏水中加入35 g马铃薯葡萄糖琼脂
摇动并混合粉末，高压灭菌20分钟
将PDA肉汤冷却至55°C
加入1 ml的100 mg/ml硫酸链霉素，1 ml的100mg/ml新霉素和1 ml的100mg/ml氯霉素，并混匀
倒入90 x 15毫米的培养皿

致谢

该协议改编自以前发表的论文（Radisek等人，2006;Jakše等人，2013; Cregeen等人，2015年） ; Mandelc等人，2013; Flajsman等人，2016）。我们承认斯洛文尼亚研究机构P4-0077研究计划的资金。

参考文献

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