材料和试剂

Miracloth（EMD Millipore，目录号：475855-1R）
滤纸（LLG，目录号：9.045 840）
磁带
塑料袋
无菌吸管技巧
2 ml微量管（BRAND，目录号：780550）
硅胶管，塑料管，玻璃管等
培养皿（Golias，目录号：PE01K）
寄主植物（hop ulus ulus ulus ulus ulus ulus，，ia ia ia ia）））））））））））））））））））））））
真菌分生孢子（非苜蓿轮枝孢霉属）;致死性病原型PV1 [分离株T2]）（Radisek等人，2006）
肥料YaraKristalon黄色NPK 13-40-13 + ME [微量元素：B - 0.025％; Cu * - 0.01％; Fe * - 0.07％; Mn * -0.04％; Mo - 0.004％; Zn * -0.025％; * - 螯合基地（Yara International ASA）
肥料YaraKristalon特殊NPK 18-18-18 + ME [ME - 微量元素：B - - 0.025％; Cu * - 0.01％; Fe * - 0.07％; Mn * -0.04％; Mo - 0.004％; Zn * -0.025％; * - 螯合基地（Yara International ASA）
生长媒介：

对于真菌接种物制剂：液体GFM-通用真菌培养基（Kayser，1992）（参见食谱）
对于植物：生长植物的无菌土壤底物
对于真菌重新分离：马铃薯葡萄糖琼脂+抗生素（硫酸链霉素，新霉素，氯霉素;每100毫克/毫升）= PDA + A板（参见食谱）

硫酸链霉素（Duchefa Biochemie，目录号：S0148）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
无菌蒸馏水（IDT，目录号：231-791-5）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
96％乙醇
蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：73049-73-7）
酵母提取物（AMRESCO，目录号：J850）
葡萄糖（Kemika，目录号：07051）
硝酸钾（KNO 3）（EMD Millipore，目录号：105063）
马铃薯葡萄糖琼脂（Biolife，目录号：4019352）
新霉素（Duchefa Biochemie，目录号：M0135）

设备

塑料盆（1升，2升）
500毫升锥形瓶（BRAND，目录号：92824）
旋转振动筛（Infrost，目录号：29313）
2升塑料杯（BRAND，目录号：87822）
生长室（Kambič实验室设备，型号：RK-13300）
荧光灯（Idealo，型号：Osram Fluora L 58 W/77）
Thoma计数室（BRAND，Wertheim，Germany）
木棍用于跳跳的支持
手镯和镊子
光学显微镜（Nikon Instruments）
Scholander压力室（土壤水分设备，型号：3005）
聚苯乙烯箱与冰

程序

宿主植物的制备
1. 使用一年龄的盆栽啤酒花植物从敏感栽培品种"Celeia"的软木切片和抗性"Wye Target"中繁殖并生长在1L塑料罐中。重要的是，植物具有坚实的，较厚的茎，其直径应大于5毫米（图1）。使用植物由专业种植者生产。在温室里种植植物在雾台上。每2天浇灌一次植物，每周施肥一次，使用含有微量和微量元素（例如，0.1％YaraKristalon黄NPK 13-40-13 + ME的溶液）的叶面肥料。为了保持适当的健康状况，每周喷洒一次植物以防止害虫和叶面病害使用防护植物保护产品。
  
  图1.啤酒花茎茎的实例，品种Celeia。左侧坚强，较厚的茎。右弱，细茎。
接种物准备
1. 在装有250毫升补充有100mg/ml硫酸链霉素和100mg的液体GFM的四个500毫升锥形瓶中的每一个中，将一小块真菌菌丝体（大小为2mm球的）放置在储备的PDA板上/ml氯霉素。
2. 在室温下和黑暗中将旋转振荡器以100rpm的速度孵育约5天（将振荡器置于暗室中）（图2）。
  
  图2. 5天后生长的真菌培养物的图片。可以看到球形的白色真菌菌丝体。具有产生大量孢子的真菌分离物的培养基是钝的。
3. 通过过滤菌丝体和孢子通过miracloth（典型孔径为22-25μm）准备分生孢子接种物（孢子大小为5至7μm）：将未经高压灭菌的Miracloth（20×20cm）片放在一个2升塑料杯，手持，并逐个过滤每个烧瓶。清洗孢子并悬浮于无菌蒸馏水中。如果浓度低，则需要所有的过滤材料。
4. 使用Thoma计数室确定孢子浓度。确定一个过滤悬浮液的四次孢子浓度，并计算平均值
5. 用无菌蒸馏水将孢子浓度调至5×10 6 /分钟/ml。
6. 用于人造感染的浓度为5×10 6分配孢子/ml的接种物的最终体积应为1 L.每1次接种量最多使用12株植物。
人工感染
1. 在1L塑料盆中种植一年的啤酒花植物。用手从根部移除尽可能多的土壤基底。
2. 用无菌水冲洗根部（只需轻轻浸泡几秒钟）。
3. 然后将根浸入1L已倒入2L塑料杯的接种物中10分钟。
4. 每次处理至少接种30株植物。
5. 高压灭菌后处理剩余的真菌接种物。
6. 对照对照植物类似，但将其根部浸于无菌蒸馏水中
7. 将植物放在2L尺寸的新盆中
8. 在生长室（RK-13300，Kambič）中，在温度为22℃，相对湿度为65℃的12小时荧光光照（L 58 W/77; Fluora，Osram）下生长植物作为单一生物光照期间为20％，暗期为70％。在室内生长期间，每周给植物两次施肥，并且每周施用一次含有较高氮含量的叶面肥（例如，0.2％的YaraKristalon特殊NPK 18-18-18 + ME）
木质部汁液提取
1. 接种后30天取样植株（±3天）
2. 拔掉啤酒花植物。仔细地从根部除去土壤，但不要将其在水中洗涤。
3. 用手术刀或刀片切割地面5-10厘米的植物（图3）。使用植物的下部（根侧有5-10厘米的茎）用于木质部汁液提取，并丢弃植物的上部（含有茎和叶的其余部分）。用无菌蒸馏水清洗切面（使用100μl移液管将数滴水滴至表面，并用滤纸浸泡水）。
  
  图3.使用手术刀或刀片将地板切成5-10厘米的植物
4. 将根放在塑料袋中（图4），用胶带密封在杆的底部。塑料袋不需要很好地密封，因为它只用于保护Scholander压力缸不会变脏。将杆插入Scholander压力缸的金属盖（图5）
  
  图4.根部放在塑料袋中
  
  图5.具有切割植物茎的Scholander压力缸的金属盖。植物茎被放置在Scholander压力缸的上部。
5. 将根侧放在Scholander压力室（Scholander等人，1965）中，并从无菌移液管尖端进行安装，将木质部汁液引导到放置在冰上的微管（图6）。任何其他安装（例如，硅胶管，塑料管，玻璃管，等）可用于将木质部汁液引导到微管。 >
  
  图6.用Scholander压力室进行木质部汁液提取。左：从移液管安装，用于引导木质部汁液到微管;右：使用Scholander压力室提取木质部汁液。将微管置于冰上，施加2-2.5巴的压力
6. 施加2-2.5巴的压力来提取木质部液体。
7. 用滤纸涂抹第一滴渗出液以避免韧皮部污染。
8. 然后将含有高达20μl1x蛋白酶抑制剂混合物的微管（它们必须放在冰上）收集木质部汁液（图7）达3小时。
9. 将木质部汁液的样品在-80°C储存，直到分析
  
  图7.从移液器技巧安装中可以看到木质部汁液流。。
10. 使用根部进行真菌学重新分离病原体，以确认接种植物中病原体的存在。在层流中进行重新隔离。用96％乙醇喷洒茎，并将其放置在明火上，以便对表面进行灭菌。从接种的植物收获木质部，并将它们放在PDA + A板上。木质部实际上是茎的整个内部，它应该被切成1-2厘米长的碎片。在PDA + A板上放置三至六块植物。在室温下在黑暗中孵育3-5天后，可以检测到真菌生长物（图8）。通过光学显微镜检查出现的菌丝体（如果有的话）。
  
  图8. 3-5天后木质部切片的真菌生长。白色和蓬松的菌丝体是非洲苜蓿的典型。真菌菌丝体优选在植物材料上生长（木质部切片由菌丝体完全长满），而不是在PDA培养基上生长。

数据分析

通常在3小时提取中从单一植物中收集高达2ml的木质部汁液。
预期木质部中的蛋白质浓度非常低;因此将3-10个单株植物（5-10ml木质部汁液）的样品合并成一个生物复制品。根据我们的经验，合并样本的估计浓度范围在5-20 ng /μl。

笔记

如"程序"一节（部分"B.接种物制备"，步骤6）中所述，每一个体积的接种物（其浓度为5×10 6）的最大12株植物分生孢子/ml）。在这些植物的根浸时，接种物被稀释。如果有更多的植物接种相同的接种物，则必须通过加入新鲜的分生孢子将所用接种物的浓度回收至5×10 6分配孢子/ml。更好地准备浓度为5×10 6 /分钟/ml的新接种物。
我们建议植物在木质部汁液取样之前一天浇水。
关于木质部汁液提取

提取汁液的植物应在地上5-10厘米处切割。我们建议不要削减更高，因为我们已经观察到我们获得较少量的具有较长茎的木质部汁液。
对于每个新植物，使用无菌手术刀切割茎，新的滤纸以吸取韧皮部滴和新的移液管尖端安装，将木质部汁液引导到微管。
当植物茎放置在Scholander压力室的金属盖上时，茎周围的橡胶圈不应该被拧紧太多，以使木质部液体流出。
我们建议收集木质部汁液最多三个小时，因为延长时间无助于增加木质部液体的量。
经过三个小时的收集，从移液管尖端移除安装，将木质部汁液从切割杆导向微管，并用手持移液器手动清空。本步骤回收约100μl木质部液体。
该协议的用户可以预期，由于未知的原因，不能从一些植物获得木质部流体。

必须使用光学显微镜对再隔离板上的新生菌丝进行形态学分析，以确认V的存在。 nonalfalfae 。 V的空气菌丝体非苜蓿通常是丰富的，絮状的，细菌的，菌丝是光滑的，宽1.5-3μm。分生孢子梗是直立或倾斜的，通常是确定的，分枝的或不分枝的，在整个殖民地和透明质素中不连贯地形成。

食谱

GFM
2克蛋白胨
2克酵母提取物
20 g葡萄糖 1 g KNO <3>
在1000毫升蒸馏水中混合，高压灭菌20分钟
PDA用300毫克/毫升抗生素

在1000 ml蒸馏水中加入35 g马铃薯葡萄糖琼脂
摇动并混合粉末，高压灭菌20分钟
将PDA肉汤冷却至55°C
加入1 ml的100 mg/ml硫酸链霉素，1 ml的100mg/ml新霉素和1 ml的100mg/ml氯霉素，并混匀
倒入90 x 15毫米培养皿

致谢

该协议是从以前发表的论文"Flajsman等"，2016年改编而来的。我们承认斯洛文尼亚研究机构P4-0077研究计划的资金。我们感谢生物技术学院应用植物学主席Dominik Vodnik博士使用他们的Scholander压力室。

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