材料和试剂

50ml管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
5 ml Falcon聚苯乙烯（PS）圆底管（Corning，Falcon ^®，目录号：352058）
100μm尼龙细胞过滤器（Corning，目录号：431752）
玻璃滑块Superfrost（生物系统，目录号：85-0551-00）
6-10周龄的同源CD90.1或CD45.1小鼠作为供体（C57BL/6背景上的内部繁殖的小鼠，最初购自美国的JACKSON LABORATORY）
注意：

使用同源小鼠CD90.1作为供体，以容易地区分供体（CD90.1）和受体细胞（CD90.2），但是也可以使用C57BL/6小鼠作为供体。
可以使用超过10周龄的供体老鼠，但是天真的CD4 CD45RB 预期T细胞随年龄增长而降低。

10-16周龄幽门螺杆菌阳性C57BL/6 Rag2 //> 或 Rag1 -/- 小鼠（最初购自美国的JACKSON LABORATORY，美国），以无特定病原体（SPF）条件作为受体，其体重至少为20克，注意：

> 小鼠也可以用作收件人。然而，结肠炎诱导的动力学被延迟，并且在那些幽门螺杆菌阴性小鼠中的CD4T细胞介导的结肠炎诱导之后的给定时间，疾病活动的变化可能会很大变化。
幽门螺杆菌存在的阳性可以通过PCR使用从粪便丸提取的基因组DNA进行评估，如Brasseit等人，2016所述。
我们没有观察到男性和女性接受者之间结肠炎诱导的动力学有任何差异。

0.5M EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：27285），钠形式
EasySep ^TM小鼠链霉亲和素RapidSpheres ^{TM隔离试剂盒（STEMCELL Technologies，目录号：19860）}
MAb抗小鼠CD4（克隆GK1.5）（BioxCell，目录号：BE0003-1）

抗小鼠抗体

抗体	公司	目录号	克隆	稀释
B220生物素	BioLegend	103203	RA3-6B2	1：800
CDαBiotin	BioLegend	100703	53-6.7	1：200
CD45RB FITC	Affymetrix	11-0455-85	C363-16A	1：800
CD25 PE	BioLegend	102008	PC61	1：800
CD4 APC-Cy7	BioLegend	100526	RM4-5	1：800

马血清（HS）（Sigma-Aldrich，目录号：H1270）
台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
4％缓冲福尔马林（EMD Millipore，目录号：100496）
乙醇（EMD Millipore，目录号：100983）
二甲苯（VWR，目录号：28975）
石蜡（Engelbrecht，目录号：17932）
Mayer's hemalum（苏木精）溶液（EMD Millipore，目录号：109249）
二甲苯基安装介质Eukitt ^®（Sigma-Aldrich，目录号：03989）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：106406）
二钠磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4·2H 2 O）（EMD Millipore，目录号：106580）
磷酸氢二钾三水合物（K 2 HPO 4·3H 2 O）（EMD Millipore，目录号：105099）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：31107）
碳酸氢钾（KHCO 3）（EMD Millipore，目录号：104854）
曙红 - 福洛辛溶液（VWR，目录号：341973R和10047229）分别为
冰醋酸（EMD Millipore，目录号：100063）
盐酸（EMD Millipore，目录号：100317）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
ACK红血溶解缓冲液（参见食谱）
曙红 - 福洛辛溶液（见配方）
0.5％HCl - 乙醇（参见食谱）

设备

离心机
Neubauer室（血细胞计数器）
EasySep ^TM磁铁（STEMCELL Technologies，目录号：18000）
BD FACS ARIA III（BD，型号：BD FACS ARIA III）
Tissue-Tek VIP 6组织处理器（SAKURA，型号：Tissue-Tek VIP 6 Vaccum Infiltration Processor）
Tissue-Tek ^® uni-cassette ^®（SAKURA，目录号：4172）
加热块
解剖套件（镊子和剪刀）
冷板（-10°C）
切片机（Leica Biosystems，Wetzlar，Germany）
水浴
移液器
CO ₂室
注意：根据瑞士联邦和州动物实验规则，CO ₂被用作经批准和推荐的安乐死方法。

软件

Graphpad Prism 6（La Jolla，CA; https：//www。 graphpad.com/scientific-software/prism/）

程序

选择天真的CD4 ⁺ T细胞
1. 在第0天，将脾从供体CD90.1小鼠中分离出来。每2个接收者使用1个脾脏小鼠。
2. 在100μm尼龙过滤器上分解脾脏，并用PBS/2％马血清（HS）冲洗过滤器，以获得单细胞悬浮液。
3. 以370×g旋转细胞悬浮液5分钟。
4. 通过将细胞沉淀物重悬于3ml ACK裂解缓冲液中3分钟来溶解红细胞。
5. 用PBS/2％HS洗涤细胞，并将细胞沉淀重新悬浮于含有5mM EDTA的1ml PBS/2％HS中。
  注意：细胞再悬浮的初始体积不是非常重要的，因为细胞必须被计数并调整到1×10 8细胞/ml，如下面的步骤所示。
6. 使用血细胞计数器计数细胞数，并将细胞浓度调整至1×10 8细胞/ml。
7. 加入50μl/ml所提供的大鼠血清（来自EasySep ^TM小鼠链霉抗生物素蛋白RapidSpheres TM分离试剂盒），并与生物素化抗体（抗小鼠B220和CD8α）一起温育。通过移液小心地混合细胞。
8. 将含有细胞悬浮液的管放在冰上15分钟。
  注意：添加抗小鼠抗体后，必须通过移液小心混合细胞。含有细胞再悬浮的管可以保留在冰上，无需进一步的混合/反转/摇动。
9. 涡旋链霉亲和素RapidSpheres ^{TM 30分钟，并向细胞悬液中加入85μl/ml的RapidSpheres TM。
  注意：不需要RapidSpheres ^{TM的初始洗涤步骤，因为它们倾向于沉淀在管的底部，因此涡旋RapidSpheres ^TM是至关重要的。 em>}}
10. 通过上下移液仔细混合，并在室温下孵育2.5分钟。
11. 使用含有5mM EDTA的PBS/2％HS将细胞悬浮液总体积为2.5ml，并转移至5ml PS管中。
12. 将含有细胞悬浮液的5ml PS管放置在EasySep ^TM磁体中2.5分钟。
13. 在一个连续的运动中，将磁体反转并小心地将细胞部分（链霉抗生物素蛋白RapidSpheres ^{TM未结合部分）倒入新的5ml管中，将磁体和管置于倒置位置2-3秒以确保细胞悬浮液的最佳转移。
  
  图1.使用供体小鼠脾细胞的T细胞富集方法}
14. 将PBS/2％HS中的细胞在370×g下洗涤5分钟。
15. 在1ml抗小鼠CD45RB FITC，CD25 PE和CD4 APC-Cy7中染色细胞。通过移液小心地混合细胞。将含有细胞悬浮液的管放置在冰上20分钟，无需进一步混合/反转/摇动
16. 在PBS/2％HS之前洗涤细胞（富含CD4 + T细胞），然后在CD4细胞上分离CD4 +/CD40R细胞BD FACSARIA III细胞分选机。
  
  图2.来自供体C57BL/6同源小鼠脾脏的初始CD45RB T细胞的选择策略首先根据其前向和侧向散射特性选择淋巴细胞，然后排除双胞胎细胞。通过从单门选择CD25阴性淋巴细胞排除调节性和活化的T细胞，最后，基于CD4和CD45RB的高表达选择初始CD4 + T细胞。
17. 收集1 ml HS（100％HS）中的分选细胞。
18. 在37℃下，将PBS中的分选的CD4 ⁺ CD45RB hi T细胞洗涤5分钟，并以1×10 4的浓度重悬于PBS中> 6 cells/ml。
  注意：始终将细胞保持在冰上。如果排序天真的CD4 ⁺ T细胞不能立即注射，将细胞保持在HS上。注射前只用PBS清洗和重悬细胞。
19. 为了诱导结肠炎，将具有2×10 5个CD4 +细胞的C57BL/6Rag2 + CD45RB ^hi腹膜内（ip）体积为200μl的T细胞。
20. 一旦动物结肠（见方法B），每次注射间隔72小时，用250-500μg抗CD4耗竭抗体注射动物三次以诱导缓解。
  注意：如Brasseit等人，2016所述，首先使用500μg的αCD4消耗性抗体进行缓解诱导。在我们的实验中，我们仍然可以达到相同水平的CD4 ⁺ T细胞消耗和类似的缓解诱导动力学，使用3种250μgαCD4消耗抗体的处理。
21. 在用抗CD4耗竭抗体进行第一次治疗后，每天监测动物的体重变化和正常活动，结肠炎症的复发预期在22-25天左右（在幽门螺杆菌阳性受体中）。
  注意：为了评估结肠炎的发展，每天监测小鼠，因为结肠炎诱导的动力学强烈依赖于微生物群的组成，意味着疾病进展可能因一个SPF小鼠家庭设施的动物而异。根据我们的经验，在幽门螺杆菌阳性小鼠T细胞转移的第9-10天左右和幽门螺杆菌阴性小鼠T细胞转移后大约第30天发现结肠炎的临床和组织病理学征象。在幽门螺杆菌阳性受体小鼠中，血液中明显的体重减轻（约10％）和凝血性CD4 ⁺ T细胞的出现非常迅速地从一天到另一天发生。此外，我们通常观察到体重减轻与幽门螺杆菌阳性但不是幽门螺杆菌阴性受体的肠道炎症程度强烈相关。
临床和组织病理评分
1. 血液中具有活动性肠道炎症（临床评分≥8）和可检测的CD4 T细胞的小鼠被认为是结肠炎。为了测量血液中的CD4 ⁺ T细胞，通过尾静脉在1ml PBS/2％HS/5mM EDTA中收集2-3滴血液。通过在370×g离心5分钟将细胞旋转下来。通过移液将细胞重悬于含有抗小鼠CD4抗体的100μlPBS/2％HS（参见材料和试剂部分用于抗体稀释）。在冰上孵育15分钟后，以PBS/2％HS洗涤细胞，并在流式细胞仪上分析。
2. 对于临床疾病评分，每天监测以下参数：
3. 对于组织学疾病评分，收集结肠（中）切片用于苏木精和伊红（H& E）染色。
  
  图4.用于组织学的结肠组织切片的收集
4. 以盲法测量以下参数（这应由经验丰富的病理学家完成）。更多信息，请参阅Brasseit等人的发表。。
石蜡包埋和H& E染色
注意：石蜡包埋和H& E染色通常在我们的组织学核心实验室设施中使用Tissue-Tex VIP 6上的全自动化程序进行，但基本步骤如下所述。
1. 在单片盒中收集1cm结肠组织（中间部分），并在室温下固定在4％缓冲的福尔马林中。
2. 如下处理组织（使用自动组织处理器）：
  1. 4％缓冲福尔马林，在35℃下1.25小时。
  2. 蒸馏水在室温下15分钟。
  3. 70％乙醇在35℃下1.5小时。
  4. 80％乙醇在35°C下1小时。
  5. 95％乙醇在35°C下1.5小时。
  6. 100％乙醇在35°C下1小时（每次1小时3次）
  7. 二甲苯在35℃下1小时（每次1小时两次）
  8. 石蜡在60℃下45分钟（四次变化45分钟）。
  注意：需要乙醇，二甲苯和石蜡的改变以减少以前步骤中的试剂携带量。
3. 嵌入石蜡块。选择对应于磁带盒尺寸的合适的模具。
4. 打开磁带并丢弃盖子。
5. 将一些液体石蜡加入到模具中，将其放置在60℃的加热块上，以防止石蜡固化。
6. 使用温镊将组织转移到模具中，使得镊子可以用于将组织从盒转移到模具而不固化石蜡。
7. 将模具放在冷板（-10°C）上，开始固化石蜡，并立即用镊子将组织向下压。
8. 将薄纸盒放在模具顶部并牢固按住。确保有足够的石蜡覆盖塑料盒。
9. 等待石蜡固化，使石蜡块容易从模具中脱出。
10. 使用切片机切割5μm切片。简单地说，将刀片插入支架并将刀片的角度调整到5°。将石蜡块放在物体夹中，并调整到所需的方向。切割几个部分（10μm）以暴露组织表面。一旦组织被暴露并且组织切割是光滑的，则将部分厚度调节到5μm。用镊子小心地取出5μm的组织切片并将其漂浮在37℃的温水浴中。在干净的玻璃载玻片上收集切片，并在加热板上在40℃下干燥20分钟。
11. 用苏木精和曙红染色，首先用二甲苯将载玻片脱蜡5分钟。
12. 用二甲苯冲洗两次，并通过以下顺序冲洗将水合玻片再次水化：
  1. 绝对乙醇（两个变化）;
  2. 95％乙醇
  3. 70％乙醇
  4. 蒸馏水
  注意：这里没有规定确切的体积，因为这将取决于玻璃染色罐的尺寸。我们建议幻灯片必须完全浸没在指定的试剂中。
13. 用Mayer's hemalum溶液染色7分钟，用自来水冲洗。
14. 用0.5％HCl - 乙醇漂白几秒钟（取决于所需的细胞核的染色深度），并立即用自来水洗涤载玻片，然后在自来水中进行10分钟的蓝色步骤。
15. 用70％乙醇冲洗。
16. 使用曙红 - 菲洛昔康溶液进行抗菌染色2-3分钟。用70％乙醇冲洗两次
17. 通过以下顺序冲洗去除水滑梯：
  1. 70％乙醇
  2. 95％乙醇
  3. 绝对乙醇（总共两个变化）
  4. 二甲苯（总共两个变化）
  注意：这里没有规定确切的体积，因为这将取决于玻璃染色罐的尺寸。我们建议幻灯片必须完全浸没在指定的试剂中。
18. 搭载Eukitt ^®

数据分析

在实验设计的设计中，建议包括4-5只小鼠/组，进行2-3次独立实验。为了进行数据分析，将接受初始CD45RB T细胞（实验组）的受体小鼠与接受CD45RB细胞的对照组（对照组，无结肠炎）进行比较。为了评估统计学意义，请使用Graphpad Prism 6（La Jolla，CA）上的不配对的测试。

笔记

为了确保最佳的细胞产量和生存力，除非另有说明，否则始终在冰上工作
为了在离心后除去上清液，吸出上清液并丢弃，而不是将其倒出，因为细胞不能牢固地粘附到5ml的PS管的底部。
对于细胞再悬浮，这应该使用移液器轻轻地进行，而不是通过涡旋。
注射细胞之前，通过反转管上下混合细胞，以确保所有小鼠注射相同数量的细胞。
为了腹腔注射，在注射细胞之前，确保针头正确插入腹腔。
如果 ^-/-收件人是从另一个鼠标房屋设施导入的，建议将这些老鼠放置至少两周之前，天真的CD4 ⁺ T细胞转移以允许微生物群的稳定化。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl
1.69mM Na 2 HPO 4·2H 2 O/
8.63mM K 2 HPO 4·3H 2 O
ACK红血溶解缓冲液
150mM NH 4 Cl
10mM KHCO 3
0.1 mM EDTA
曙红 - 氟洛芬溶液
100ml 1％伊红储备液
10ml 1％的福洛辛储备液
780毫升95％乙醇 4毫升冰醋酸
0.5％HCl - 乙醇
20毫升25％盐酸
980毫升70％乙醇

致谢

这项工作得到了瑞士国家科学基金会Sinergia补助金给Andrew Macpherson，Christoph Mueller，Wolf-Dieter Hardt和Daniela Finke以及C.M.的SNSF拨款31-138392的支持。描述的方案首先在Brasseit等人，2016年概述。

参考文献

Brasseit，J.，Althaus-Steiner，E.，Faderl，M.，Dickgreber，N.，Saurer，L.，Genitsch，V.，Dolowschiak，T.，Li，H。，Finke，D.，Hardt，WD ，McCoy，KD，Macpherson，AJ，Corazza，N.，Noti，M。和Mueller，C。（2016）。 CD4 T细胞是在可逆性结肠炎的新型小鼠模型中发展和维持疾病所必需的。粘膜免疫溶液 9 （3）：689-701。
Chassaing，B.，Aitken，JD，Malleshappa，M.和Vijay-Kumar，M。（2014）。小鼠中的硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的结肠炎。 Curr Protoc Immunol 104：单位15 25
D'Haens，G.R。，Sartor，R.B.，Silverberg，MS，Petersson，J.andRutgeerts，P。（2014）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24742736"target ="_ blank">炎症性肠病管理的未来发展方向。J.J Crohns Colitis 8（8）：726-734
Endt，K.，Stecher，B.，Chaffron，S.，Slack，E.，Tchitchek，N.，Benecke，a。，Van Maele，L.，Sirard，JC，Mueller，AJ，Heinkenwalder，M.，Macpherson ，AJ，Strugnell，R.，Von Mering，C.and Hardt，WD（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20844578"target ="_ blank">微生物群在非伤寒沙门氏菌腹泻后介导肠腔的病原体清除。 PLoS Pathog 6（8）：e1001097。
Khanna，PV，Shih，DQ，Haritunians，T.，McGovern，DP和Targan，S。（2014）。切割边缘：通过CD4 ⁺ CD25 ⁺调节性T细胞治愈结肠炎。）：3939-3943。
Perše，M. and Cerar，A（2012）。葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠模型：陷阱和技巧。生物医学生物技术 2012：718617.
Pineton de Chambrun，G.，Peyrin-Biroulet，L.，Lemann，M.and Colombel，JF（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm。 nih.gov/pubmed/19949430"target ="_ blank">用于管理IBD的粘膜愈合的临床意义。 Nat Rev Gastroenterol Hepatol 7（1）：15-29。 br />
Reinisch，W.，Sandborn，WJ，Hommes，DW，D'Haens，G.，Hanauer，S.，Schreiber，S.，Panaccione，R.，Fedorak，RN，Tighe，MB，Huang，B.，Kampman， W.，Lazar，A.和Thakkar，R。（2011）。阿达木单抗用于诱导中度至重度活动性溃疡性结肠炎的临床缓解：随机对照试验的结果。 60（6）：780-787。
Rutgeerts，P.，Sandborn，WJ，Feagan，BG，Reinisch，W.，Olson，A.，Johanns，J.，Travers，S.，Rachmilewitz，D.，Hanauer，SB，Lichtenstein，GR，de Villiers，WJ ，Present，D.，Sands，BE and Colombel，JF（2005）。英夫利昔单抗用于溃疡性结肠炎的诱导和维持治疗。 N Engl J Med 353（23）：2462-2476。
Sandborn，WJ，van Assche，G.，Reinisch，W.，Colombel，JF，D'Haens，G.，Wolf，DC，Kron，M.，Tighe，MB，Lazar，A.and Thakkar，RB（2012）。阿达木单抗诱导并维持中度 - 严重溃疡性结肠炎。胃肠病学 142（2）：257-265 e251-253。
Sonnenberg，GF，Monticelli，LA，Elloso，MM，Fouser，LA和Artis，D。（2011）。 CD4 ⁺淋巴组织诱导细胞促进肠内先天免疫。 34（1）：122-134。