材料和试剂

注意：来自不同供应商的可比较试剂可用于该方案。

150毫米组织培养皿（Corning，Falcon ^{®，目录号：353025）}
15ml离心管（Corning，目录号：430790）
5ml移液器（VWR，目录号：89130-908）
转移移液器（Denville Scientific，目录号：P7222）
30毫升玻璃管（Corning，Corex ^{®，目录号：1-8445-30）
注意：本产品已停产。}
1.7ml微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
移液器提示
0.1-10μl（Corning，目录号：4153）
1-200μl（Corning，目录号：4126）
100-1,000μl（Corning，目录号：4129）
250毫升具有0.2微米PES膜的无菌一次性过滤器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：568-0020）（用于缓冲液I和缓冲液II）}
60 ml注射器（BD，目录号：309653）（用于缓冲液IV.80，IV.150，IV.300和IV.600）
25毫米注射器过滤器（Pall，目录号：4612）（用于缓冲液IV.80，IV.150，IV.300和IV.600）
A549细胞（ATCC，目录号：CCL-185）
Ham's F-12K细胞培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：21127-022）}
胎牛血清（FBS）（VWR，目录号：89510-182）
青霉素 - 链霉素（Pen/Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140-122）}
胰蛋白酶-EDTA（0.25％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200-056）}
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Mediatech，目录号：21-030-CM）
液氮
NP-40/IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）（H 2 O 2中的10％储备溶液）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）（0.1M异丙醇储备溶液）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：10197777001）（1M HEPES缓冲液中的储备溶液，pH 7.75）
蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）（根据制造商的说明书，在H 2 O中制备为50x储备溶液）
微球菌核酸酶（MNase）（Sigma-Aldrich，目录号：N3755）（0.2U /μlH 2 O中的储备溶液）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）（0.1mM H 2 O，pH = 10）
PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
橙色G（Sigma-Aldrich，目录号：O3756）（0.35％[w/v]橙G，用于6x储备溶液的H 2 O 3中的30％[w/v]蔗糖） >
100 bp DNA ladder（New England Biolabs，目录号：N3231）
广泛的蛋白质梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：26623）
GelRed核酸凝胶染色（Biotum，目录号：41003）
LDS样品缓冲液（4x）（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，目录号：NP0007）}
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：BP220-1）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）（1M H 2 O中的1M储备溶液）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）（H 2 O 5中的5M储备溶液）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）（1M H 2 N中的储备溶液 O）
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）（H 2 O的1M储备溶液用HCl调节至pH 7.4）
UltraPure琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：16500500）}
盐酸6.0N溶液（HCl）（Fisher Scientific，目录号：MK-H168-4）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）（0.5M H 2 N中的储备溶液< O）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
将HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）（用NaOH调节至pH 7.9的H 2 N中的1M储备溶液）
氢氧化钠（NaOH）（AMRESCO，目录号：M137）
缓冲液I.A和I.B（见配方）
缓冲液II（参见食谱）
缓冲液III.A和III.B（见配方）
缓冲液IV.80，IV.150，IV.300和IV.600（见配方）
低音缓冲（见配方）

设备

注意：具有类似性能的设备可能用于协议，但是，我们建议使用特定类型的可重复使用的离心管（列在5中），以确保高质量的细胞核隔离。

CO 2细胞培养箱（BINDER，目录号：9040-0082）
台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-14R）
用于台式离心机的转子（Beckman Coulter，型号：SX4750用于组织培养，FX6100适用于10,000 x x 旋转，或适用于高速度的精密转子）
FX6100转子适配器（Beckman Coulter，目录号：392830）
30 ml可重复使用的离心管（Sigma-Aldrich，目录号：T2793）
台式离心机5424 R（Eppendorf，型号：5424 R）
具有紧密杵的1ml组织研磨机（Dounce均化器）（Ace Glass Incorporated，目录号：8343-01）
水浴（Fisher Scientific，型号：Isotemp ^TM数字控制水浴215型，目录号：15-462-15Q）
管旋转器（VWR，目录号：10136-084）
移液器
1-10μl（Gilson，目录号：F144055P）
2-20μl（Gilson，目录号：F144056M）
20-200μl（Gilson，目录号：F144058M）
100-1,000μl（Gilson，目录号：F144059M）
琼脂糖凝胶电泳系统（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Owl EasyCast B1A系统）}
荧光和化学发光凝胶成像系统（Syngene，型号：G：BOX Chemi XT4）
热块（Fisher Scientific，型号：Isotemp ^{TM数字干浴/块加热器，目录号：88-860-022）}
蛋白质电泳仪（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels，目录号：1658005）
Western印迹装置（Thermo Fisher Scientific，型号：SureLock ^TM小细胞电泳系统）

软件

ImageJ（可从国立卫生研究院免费获得）， https://imagej.nih.gov/ij/）

程序

细胞培养
注意：该方案针对大约4×10 7个A549细胞的核分离和染色质分级进行了优化（对于约2个100％汇合的150mm细胞培养皿的A549细胞）。选择此数量的细胞用于有效的核分离，如方法B所述。该方案可用于其他细胞类型，但应相应优化。
1. 对于每个条件，在10％FBS和1％Pen/Strep的F-12K培养基中生长大约4×10 7个 A549细胞。
  注意：在收获时达到所需的细胞数量的时间处理。
2. 收获细胞使用胰蛋白酶，并结合成一个15毫升管每个条件
3. 使用台式离心机（带转子SX4750的Allegra X-14R）离心2分钟，500 x g，室温。
4. 用10ml PBS洗涤细胞一次，再次离心2分钟，500×g，室温。
5. 吸取尽可能多的上清液，而不会干扰细胞沉淀。
6. 在液氮中闪蒸冷冻样品
7. 将样品储存在-80°C直到准备好处理。
核隔离
注意：本节介绍核隔离的两种替代方法。 B1中详细描述的程序产生了一个干净的核心部分，但推荐使用B1，如B1中所述使用温和洗涤剂时，从核心部分丢失的高度可移动的核蛋白质（见图2中的示例）。 >

图2.核蛋白HMGB1的分馏可以根据核分离方法而有所不同。使用不同的核分离方法对A549细胞的染色质分级进行Western印迹。使用NP-40和蔗糖垫，核分离期间HMGB1从细胞核中丢失。使用步骤B2中描述的替代方法，HMGB1在核分离过程中保留在核部分中
1. 使用温和的洗涤剂和蔗糖垫进行核分离注意：本节介绍使用温和洗涤剂（NP-40）透化细胞膜，然后通过蔗糖垫将细胞核与细胞质碎片分离。蔗糖垫层由底部含有1.2M蔗糖的层（缓冲液II）和顶部具有0.32M蔗糖的层（缓冲液I，图3A）组成。细胞核比1.2 M蔗糖缓冲液更致密，并在管的底部沉淀，而较低密度的细胞质碎片将保留在上层蔗糖层中（图3B）。
  1. 在冰上解冻细胞（约10分钟，直到颗粒松散）
  2. 同时，通过在使用前立即加入PMSF，DTT和蛋白酶抑制剂混合物来制备每个缓冲液I.A和I.B的一个等分试样（见配方的最终浓度）。将NP-40加入缓冲液I.B.
  3. 使用5ml移液管将细胞轻轻重悬于2ml缓冲液I.A中。避免形成气泡。
  4. 将50μl细胞悬浮液放在标有"细胞级分"的新管中
  5. 将2ml含有NP-40的缓冲液I.B加入2ml细胞悬浮液中，轻轻倒入管中2-3次。
  6. 将样品在冰上孵育10分钟。 5分钟后轻轻混合。
  7. 将8ml冰冷的缓冲液II吸入30 ml可重复使用的离心管中（每个样品一个）。
  8. 小心地将细胞悬液悬浮于缓冲液II上（图3A）
  9. 如果管的数量是均匀的，则在离心之前将管与缓冲液I.A平衡。如果管道数量不均匀，请使用含水的额外管道作为平衡
  10. 使用带有低制动器的台式离心机（具有转子FX6100的Allegra X-14R）离心20分钟，10,000℃，4℃，该离心机型号减速设定1，其他减速5-10分钟离心机型号）以避免颗粒破裂。
    注意：使用4号设备部分列出的适配器将30 ml可重复使用的离心管装入FX6100转子。细胞核在管的底部形成致密的颗粒，而细胞质碎片保留在上层蔗糖层中，图3C。
  11. 使用移液器小心地去除上清液。保留含有核的沉淀物，并进行到程序C.
    
    图3.核分离的中间步骤。 A.蔗糖垫层。 1 =细胞重悬浮于含有0.32M蔗糖的缓冲液I中。 2 =含有1.2M蔗糖的缓冲液II。使用透明玻璃管更好地了解两层。 B.在30ml可重复使用的管中离心步骤之前看到的蔗糖层的层。层1 =缓冲区I.层2 =缓冲区II。 C.在30ml可重复使用的管中离心步骤后观察到蔗糖层的层。层1 =缓冲区I.层2 =缓冲区II。 D和E.以红色箭头表示的10,000×g旋转后的核粒子。在拍摄照片之前，将缓冲区删除。
2. 通过手动中断进行核隔离
  注意：使用温和的洗涤剂如NP-40进行核分离是重要的，以确保核膜保持在很大程度上完好无损。在某些情况下，高度移动的核蛋白如HMGB1（Sapojnikova等人，2005）可以通过该方法分离而扩散出细胞核。为了防止这些蛋白质从核部分的损失，我们调整了一种替代方法，依靠低渗缓冲液和随后使用Dounce匀浆器手动破坏细胞膜。在这个步骤中的短离心时间使这些蛋白质从细胞核中的扩散最小化（图2）
  1. 在冰上解冻细胞（约10分钟，直到颗粒松散）
  2. 轻轻将细胞悬浮于1ml低渗缓冲液中，并使用P1000移液管（或宽孔吸头）将其转移到1.7 ml管中，以避免破坏细胞膜。
  3. 将新鲜管中的细胞悬浮液25μl作为"细胞分数"放在一边。
    注意：这与步骤B1中从2ml细胞悬浮液中取出的50μl等分试样成比例。
  4. 在冰上孵育30分钟。
  5. 将Dounce均化器和杵在冰上预冷至少5分钟。
  6. 使用移液器将细胞悬浮液转移至冷的Dounce匀浆器。
  7. 使用40次紧密的杵破碎细胞膜。最小化气泡的形成。
  8. 使用转移移液管将样品转移至1.7 ml管。
  9. 使用台式离心机离心5分钟，1,500 x g，4°C。
  10. 用P1000移液管小心地清除上清液。如果需要，转移上清液并将其标记为"细胞质分数"。保留含有核的沉淀物，并进行到程序C.
    注意：细胞核在管底部形成松散的颗粒，容易受到干扰。步骤B1中的细胞质部分太稀，不能由于蔗糖垫而分离出来。
微球菌核酸酶消化
注意：在该步骤中，使用MNase将DNA消化成单核小体的长度（约150bp）。虽然部分MNase消化与盐分离的核分离可以用于将异染色质与异染色质分离（Teves和Henikoff，2012），我们的方案旨在鉴定蛋白质与染色质的全球关联，并且不区分不同类型的染色质。随后，重要的是将DNA完全消化成单核小体以分解染色质并允许在步骤D中洗脱所有可溶性蛋白质（图4）。使用EGTA代替EDTA以停止MNase消化，因为EGTA优先螯合MNase酶活性所必需的Ca 2+离子，但不影响Mg ^{2 +} 离子对蛋白质 - 蛋白质相互作用是重要的。蛋白质在MNase消化过程中松散地结合染色质洗脱，并且可以在方案本部分收集的上清液中检测到。

图4.使用MNase消化细胞DNA 在MNase治疗的时间过程中从细胞核提取的DNA的琼脂糖凝胶分析。对应于单，双和三核小体的DNA条带的位置在左侧表示，而碱基对（bp）的DNA大小在右侧表示。没有MNase消化（0分钟），由于DNA分子的大小，细胞DNA几乎不能进入琼脂糖凝胶。在MNase消化1分钟后，DNA片段显示150bp倍数的特征条带图。 5分钟后，DNA片段长度对应于一至三个核小体。 30分钟后，大多数DNA片段接近150bp，表明最佳染色质分级所需的细胞DNA需要消化。 DNA的高浓度导致单核小体带的稍微偏移。使用方法B.1分离用于该时间过程的核。使用方法B.2分离细胞核后，没有观察到MNase消化效率的差异
1. 缓冲液III.A和III.B.制备和冷却
2. 向核中加入400μlBuffer III.A。
3. 使用带有尖端切口的P1000移液管（或大孔吸管头）轻轻重悬核，以避免破坏核膜。
4. 加入5μl的MNase（1U），并在37℃（在水浴中）孵育30分钟。
5. 每10分钟轻轻翻转管2-3次
6. 30分钟后，加入25μl冰冷的0.1M EGTA以停止消化。
7. 将核悬浮液的60μl等分试样放在一边，将其作为"核分数"进行分离，并进行DNA分离以确认DNA的足够消化（描述于方法E中）。
8. 离心10分钟，400 x g，4°C
9. 将上清液转移到新鲜管中，并标记'MNase级分'
10. 通过将其重悬在400μl缓冲液III.B中来清洗细胞核一次
11. 再离心10分钟，400 x g，4℃。丢弃上清液。
染色质分级法注意：在该步骤中，使用具有增加量的NaCl的缓冲液进一步分级细胞核。预期只有弱结合DNA的蛋白质在低盐条件下是可溶的，并且将在低NaCl浓度的缓冲液中从细胞核中洗脱出来。与染色质紧密结合的蛋白质仅在高盐条件下才变得可溶，只能在NaCl浓度高的缓冲液中从细胞核中洗脱出来。
1. 使用P1000移液管轻轻重悬400μlBuffer IV.80中的细胞核（或大孔吸头）。
2. 在4℃旋转30分钟。
3. 离心10分钟，400 x g，4°C
4. 将上清液转移到新鲜管中，并标记'MNase级分'
5. 通过将其重悬在400μl缓冲液III.B中来清洗细胞核一次
6. 再离心10分钟，400 x g，4℃。丢弃上清液。
染色质分级法注意：在该步骤中，使用具有增加量的NaCl的缓冲液进一步分级细胞核。预期只有弱结合DNA的蛋白质在低盐条件下是可溶的，并且将在低NaCl浓度的缓冲液中从细胞核中洗脱出来。与染色质紧密结合的蛋白质仅在高盐条件下才变得可溶，只能在NaCl浓度高的缓冲液中从细胞核中洗脱出来。
1. 使用P1000移液管轻轻重悬400μlBuffer IV.80中的细胞核（或大孔吸头）。
2. 在4℃旋转30分钟。
3. 离心10分钟，400 x g，4°C
4. 将上清液转移到新鲜管中，并标记'80 mM级分'
5. 以缓冲区IV.150，IV.300和IV.600的顺序重复步骤D1-D4。分别保持上清液分数为150mM，'300mM'和'600mM'
6. 立即准备样品进行蛋白质印迹（见程序F中的表1）或-20℃储存。
DNA分离和DNA凝胶
注意：在该步骤中，在MNase消化后从样品中分离DNA以测试DNA片段的长度。目的是将DNA消化至约150bp的单核小体水平，以确保最佳染色质分馏（图4）。重要的是使用橙G或其他小分子量染料来加载DNA。通常使用的DNA负载染料如溴酚蓝的DNA大小与150 bp的DNA大小相同，可能会掩盖结果。
1. 稀释10μl的"核"级分在90μlH 2 O中，以获得更好的DNA纯化。
2. 使用PCR纯化试剂盒根据试剂盒说明书从该样品中分离DNA。在30μlH 2 O中洗脱DNA。
3. 取出5μl（约5μg）DNA，加入1μl6x Orange G.将剩余的DNA保存在冰上，直到结果完成或-20°C冻结。
4. 在含有1ml GelRed的2％琼脂糖凝胶上在100V下运行样品和100bp梯度1小时。
5. 使用凝胶成像仪可视化DNA，并用最小的DNA梯度检查大约150 bp的显着DNA条带（图4）。

通过蛋白质印迹验证核分级的质量注意：可以使用SDS-PAGE结合Western印迹分析核分馏的质量（图1G）。可以通过探测仅在细胞质中发现的蛋白质如微管蛋白来测试有效的核分离。可以通过探测组蛋白蛋白如组蛋白H3或预期结合组蛋白尾的蛋白质（例如含溴结构域的蛋白质Brd1）（Sanchez等，2014）来测试染色质分级的质量。组蛋白H3和Brd1与染色质的相互作用只能在高盐条件下被破坏。此外，可以进行蛋白质组学以鉴定不同条件下全球染色质组成的变化。有关盐馏分质谱的更多细节可以在（Avgousti et al。，2016）中找到。

根据表1，通过Western印迹制备样品进行分析。

表1.用于Western印迹的不同级分的制备

分数	示例	H ₂ O	具有10％DTT的4x LDS样品缓冲液
单元格（来自B1）	10μl	20μl	10μl
单元格（来自B2）	5μl	25μl	10μl
核/	10μl	20μl	10μl
MNase	30μl	-	10μl
80 mM	30μl	-	10μl
150 mM	30μl	-	10μl
300 mM	30μl	-	10μl
600 mM	30μl	-	10μl

在95℃（加热块）中变性样品10分钟
通过SDS-PAGE和Western印迹分析每个样品15μl。探测微管蛋白和组蛋白H3作为对照

数据分析

为了比较不同条件下感兴趣的蛋白质与染色质的关联，样品应在相同的SDS-PAGE凝胶上运行，并且不同暴露的蛋白质印迹可能会混淆解释。这里描述了各种蛋白质的预期结果，以帮助进行数据分析，尽管每个测试的蛋白质都应分开考虑。 "细胞"分数表示样品中与其他级分进行相对比较的蛋白质总量。细胞质蛋白如微管蛋白应该只存在于'细胞'部分（图1G）。核蛋白也应存在于"核"部分，如H3和Brd1所见（图1G）。剩余部分的带强度表示核蛋白在这些条件下的溶解度。 H3和Brd1在'600mM'级分中具有最高的谱带强度，这表明在染色质相关蛋白质典型的高盐条件下更高的溶解度。对于HMGB1，可以观察到"MNase"和"80mM"分数的最高频带强度，表明在低盐条件下的溶解度，表明与染色质无关。不同部分的频带强度差异可以使用ImageJ（可从National Institutes of Health，免费获得， https://imagej.nih.gov/ij/）。
有关盐馏分质谱数据分析的详细信息可参见（Avgousti等人，2016）。

笔记

该协议适用于比较不同条件下染色质相关蛋白质组的变化。我们已经使用这种方法来显示腺病毒感染期间细胞染色质的变化（Avgousti等人，2016）。

食谱

缓冲区I.A和I.B
0.32 M蔗糖
60 mM KCl
15 mM NaCl
5mM MgCl 2
0.1 mM EGTA
15 mM Tris pH 7.4
过滤并储存在4°C
添加新鲜：
0.5 mM DTT
0.1 mM PMSF
1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
只添加到缓冲区I.B：
0.1％NP-40
缓冲区II
1.2 M蔗糖
60 mM KCl
15 mM NaCl
5mM MgCl 2
0.1 mM EGTA
15 mM Tris pH 7.4
过滤并储存在4°C
添加新鲜：
0.5 mM DTT
0.1 mM PMSF
1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
缓冲区III.A和III.B 10 mM Tris pH 7.4
2mM MgCl 2
0.1 mM PMSF
只添加到缓冲区III.A：
5mM CaCl 2
缓冲液IV.80，IV.150，IV.300和IV.600
10 mM Tris pH 7.4
2mM MgCl 2
2 mM EGTA
0.1％Triton X-100
将以下浓度的NaCl加入各缓冲液中：
70 mM Buffer IV.80
140 mM Buffer IV.150
290 mM Buffer IV.300
590 mM Buffer IV.600
过滤并储存在4°C
添加新鲜：
0.1 mM PMSF
低音缓冲区
10 mM HEPES pH 7.9
1.5mM MgCl 2
10 mM KCl
0.1 mM PMSF
0.5 mM DTT

致谢

我们感谢Weitzman实验室的成员仔细阅读和修订了该协议。这项工作得到了美国国立卫生研究院（CA097093），宾夕法尼亚大学免疫学研究所和费城儿童医院（M.D.W.）资助的资助。直升机部分由T32 CA115299和F32 GM112414支持。本文描述的方案公布于Avgousti等人，2016年。

参考文献

Avgousti，DC，Herrmann，C.，Kulej，K.，Pancholi，NJ，Sekulic，N.，Petrescu，J.，Molden，RC，Blumenthal，D.，Paris，AJ，Reyes，ED，Ostapchuk，听力，P.，Seeholzer，SH，Worthen，GS，Black，BE，Garcia，BA和Weitzman，MD（2016）。核心病毒蛋白结合宿主核小体以螯合免疫危险信号。自然 535（7610）：173-177。
Chiu，YF，Sugden，AU和Sugden，B.（2013）。爱泼斯坦 - 巴尔病毒生产扩增重新编码核结构，DNA复制和组蛋白沉积。细胞宿主微生物 14（6）：607-618。
Lam，YW，Evans，VC，Heesom，KJ，Lamond，AI和Matthews，DA（2010）。腺病毒感染细胞中核仁的蛋白质组学分析。分子细胞蛋白质组学9（1）：117-130。
Sanchez，R.，Meslamani，J. and Zhou，MM（2014）。溴结构域：从表观基因组读取器到药物靶标。 Biochim Biophys Acta 1839（8）：676-685。
Sapojnikova，N.，Maman，J.，Myers，FA，Thorne，AW，Vorobyev，VI and Crane-Robinson，C.（2005）。生物化学观察核HMGB1的快速流动性。 Biochim Biophys Acta 1729（1）：57 -63。
Simpson-Holley，M.，Colgrove，RC，Nalepa，G.，Harper，JW和Knipe，DM（2005）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm .nih.gov/pubmed/16188986"target ="_ blank">涉及单纯疱疹病毒1感染期间核结构改变的细胞和病毒因子的鉴定和功能评估。 Virol 79（20）：12840-12851。
Teves，SS和Henikoff，S。（2012）。用于全基因组谱分析的核小体的盐分离。方法Mol Biol 833：421-432。