材料和试剂

35毫升TC处理培养皿（康宁，目录号：430165）
剃刀刀片
蛋白质纯化柱（Kimble Chase Life Science and Research Products，目录号：420400-1010）
移液器提示（VWR，目录号：53508-794）
50ml管（Corning，目录号：430290）
VWR 10 ml血清移液管（VWR，目录号：89130-888）
Parafilm M（Bemis，目录号：PM996）
Immobilon-P聚偏二氟乙烯膜（EMD Millipore，目录号：IPVH00010）
透析管（Sigma-Aldrich，目录号：D6191）
透析管夹（Sigma-Aldrich，目录号：Z371092）
透析管（Sigma-Aldrich，目录号：D9652）
pGEM ^® -T Easy矢量系统（Promega，目录号：A1360）
One Shot TOP10感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：C404003）}
pET-28a（+）质粒（EMD Millipore，目录号：69864）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11965092）
FBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10437028）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：15596026）
氯仿，生物技术级（VWR，目录号：97064-678）
2-丙醇，生物技术级（VWR，目录号：97065-048）
乙醇，绝对（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
DEPC处理过的水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：750023）}
5x iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：1708890）
无核酸酶水（New England Biolabs，目录号：B1500）
PCR引物（IDT）
Phusion高保真DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0530）
dNTP（New England Biolabs，目录号：N0447）
Taq DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0273）
氯化镁（MgCl 2）溶液（New England Biolabs，目录号：B9021）
dATP（100mM）（New England Biolabs，目录号：N0440S）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202）
X-Gal（β-半乳糖苷）（Promega，目录号：V3941）
SOC培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15544034）}
LB板（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10855021）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9393）
NEBuffer 3.1（New England Biolabs，目录号：B7203S）
限制酶（New England Biolabs，目录号：R0138）
I限制酶（New England Biolabs，目录号：R0189）
Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28706）
T4 DNA连接酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0202S）
IPTG（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
液氮（中西部液氮服务）
溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
RNase A（Sigma-Aldrich，目录号：R4642）
DNase I（New England Biolabs，目录号：M0303）
LDS加载缓冲液（4x）（Thermo Fisher Scientific，Noves ^{TM，目录号：NP0007）}
Ni-NTA琼脂糖（QIAGEN，目录号：30230）
Qubit蛋白测定（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：Q33211）
λ-PPase（New England Biolabs，目录号：P0753）
磷酸酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B6022S）
原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
聚I：C（Sigma-Aldrich，目录号：P1530）
NuPAGE 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：NP0322BOX）}
银染试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Noves ^TM，目录号：LC6100）
1％牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录编号：A9418）
PKR一抗（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-6282）
磷酸化PKR一抗（Abcam，目录号：ab32036）
过氧化物酶缀合的第二抗体（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：31460）}
ECL试剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：32132）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S8282）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I5513）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
Tris（pH 7.6）（VWR，目录号：97061-260）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯化镁（MgCl 2）粉末（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
甘油（VWR，BDH ^{，目录号：BDH1172-1LP）}
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
HEPES（pH 7.5）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
ATP（New England Biolabs，catalog number：P0756）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
E。大肠杆菌裂解缓冲液（参见食谱）
蛋白质纯化洗涤缓冲液（参见食谱）
蛋白质纯化洗脱缓冲液（参见食谱）
蛋白质储存缓冲液（参见食谱）
磷酸酶反应缓冲液（参见食谱）
PKR激活缓冲液（见配方）
TE缓冲区（10x）（见配方）
吐温-20磷酸盐缓冲盐水（pH 7.2）（见配方）

设备

细胞培养箱（Panasonic Biomedical，型号：MCO-230AIC）
移液器（VWR，目录号：89079-970）
离心机（Eppendorf，型号：5424）
Qubit 3.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：Q33216）}
PCR机（Bio-Rad Laboratories，型号：S1000 ^{TM热循环仪，目录号：1852148）}
涡旋（VWR，目录号：97043-562）
超声波仪（Branson，型号：Digital Sonifier 450或Fisher Scientific，目录号：15-338-553）
600毫升烧杯（VWR，目录号：10754-956）
台风扫描仪（GE Healthcare，型号：Amersham Molecular Dynamics Typhoon 9410或GMI，目录号：8149-30-9410）

程序

人PKR基因克隆
1. RNA分离和cDNA文库生成
  1. 在具有10％FBS和1％青霉素 - 链霉素的10ml DMEM的35mm培养皿中，在具有5％CO 2的37℃培养箱中将细胞生长至80％汇合。
  2. 从培养皿中取出培养基。
  3. 将1ml TRIzol试剂直接加入培养皿中的细胞
  4. 在培养皿中上下移动细胞5次以裂解细胞。
  5. 在室温下孵育样品5分钟以允许完全的核裂解
  6. 加入0.2毫升氯仿，用手强力共用管15秒
  7. 在室温下孵育2分钟。
  8. 在4℃下将样品以12,000×g离心15分钟。
  9. 通过以45°角将管倾斜取出上清液，以避免接触相间或有机层
  10. 将水相转移到新管中，加入0.5ml 100％异丙醇
  11. 在室温下孵育10分钟
  12. 在4℃下以12,000 x g离心10分钟。
    注意：RNA应作为白色颗粒可见。
  13. 从管中小心取出上清液，不要接触RNA颗粒
  14. 用4ml预冷的1ml 75％乙醇洗涤沉淀物
  15. 短暂旋转样品，然后在4℃下以7,600×g离心5分钟。
  16. 小心取出乙醇，并在冰上将RNA颗粒空气干燥15分钟。
  17. 将RNA沉淀重新悬浮于100μlDEPC处理过的水中，37℃孵育10分钟
  18. 使用Qubit 3.0荧光计，NanoDrop分光光度计或Bioanalyzer测量RNA浓度。
  19. 在冰上准备5x iScript cDNA合成反应混合物进行逆转录
  20. 使用以下程序在PCR机上孵育反应混合物：
    25°C 5分钟
    42°C 30分钟
    85°C 5分钟
    保持在4°C
  21. 将cDNA以等分试样储存在-20℃。或者，如果在几天内反复使用，将cDNA存储在4℃。避免反复冻融循环。
2. PCR扩增和亚克隆到pET-28a +质粒中可以使用其他细菌表达质粒。根据克隆位点，不同的限制酶可以用于其他质粒。
3. 转化为E。大肠杆菌
4. 将PKR基因消化和连接到pET-28a +中
来自E的PKR蛋白质纯化。大肠杆菌
1. 在LB培养液中在37℃下培养细胞，直到OD 600达到0.4-0.6
2. 用40μl100 mM IPTG（终浓度400μM）在37°C诱导3〜5 h。
3. 收获细胞并立即进行细胞裂解或将液体冷冻细胞，然后将其储存在-80°C。
4. 将细胞重悬于裂解缓冲液中，每克湿重为2-5毫升
5. 用细胞加入溶菌酶（1 mg/ml）到裂解缓冲液，并在冰上孵育30分钟。
6. 使用配有微尖头的超声波仪器在冰上超声波测量。
  注意：在每次突发之间，以30秒的时间间隔使用5秒15秒的冷却时间。
7. （可选）如果裂解物非常粘稠，加入RNase A（10μg/ml）和DNase I（5μg/ml），并在冰上孵育10-15分钟。
8. 在4℃下以10,000×g离心裂解物20-30分钟以沉淀细胞碎片并保持上清液。
9. 加入5μl2x LDS-PAGE样品缓冲液至5μl上清液，储存于-20°C进行LDS-PAGE分析。
10. 移取10ml的Ni-NTA浆液至50ml管中，并短暂离心。除去上清液并加入20 ml裂解缓冲液。反转轻轻混合。重复离心步骤并除去上清液注意：根据目标蛋白质的产量调整使用的Ni-NTA量。
11. 将澄清的裂解物加入到平衡的基质中，并在4℃下摇动1小时
12. 将10ml裂解物-NN-NTA混合物装入柱中
13. 取下底盖并收集流通。保存并储存用于Western印迹。
14. 用洗涤缓冲液洗10次。收集洗涤系统进行Western印迹。
15. 用1ml洗脱缓冲液洗脱蛋白质4次
16. 在4℃下，在储存缓冲液中进行一次透析。
17. 用蒸馏水润湿透析管，用一个夹子靠近一端关闭管子。
18. 将样品装入透析管并夹住另一端。
19. 将打结的管子放入储存缓冲液中，放入500ml烧杯中过夜
20. 通过Qubit蛋白测定法测定蛋白质浓度，并检查蛋白质的纯度（图1）
  
  图1.纯化的PKR蛋白的银染色。纯化的PKR蛋白（65kDa）通过银染色显现。加入IPTG以诱导E中的蛋白质表达。大肠杆菌。使用不含IPTG诱导细胞的裂解物作为阴性对照
PKR去磷酸化和活化
人PKR蛋白由来自E的RNA激活。大肠杆菌细胞裂解后;因此，蛋白质去磷酸化是激活测定前获得非磷酸化形式的PKR所必需的
1. PKR的脱磷酸化
2. PKR活化分析

数据分析

所有实验至少一式三份重复，数据以平均值±SD表示。统计学意义使用学生的测试来确定。 A

值< 0.05被认为具有统计学意义。本协议中描述的实验已经完成，其数据已经在Yuen等人发布，2016年，NIPBL控制RNA生物发生以防止应激激酶PKR的激活。 Cell Rep 14（1）：93-102，可以通过以下方式访问： http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247（15）01425-4 。

食谱

E。大肠杆菌裂解缓冲液（1L）
50mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl
10 mM咪唑
1 mM PMSF
10 mM蛋白酶抑制剂
使用NaOH调节pH至8.0

蛋白纯化洗涤缓冲液（1升）
50mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl
20mM咪唑
1 mM PMSF
10 mM蛋白酶抑制剂
使用NaOH调节pH至8.0

蛋白纯化洗脱缓冲液（1升）
50mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl
250毫克咪唑
1 mM PMSF
10 mM蛋白酶抑制剂
使用NaOH调节pH至8.0

蛋白质储存缓冲液
10mM Tris（pH 7.6）
50 mM KCl
2mM MgCl 2
10％甘油
7mMβ-巯基乙醇

磷酸酶反应缓冲液
50mM Tris-HCl，pH7.5
2mM MgCl 2
0.1 mM EDTA
5 mM DTT

PKR激活缓冲区
20 mM HEPES（pH 7.5）
4mM MgCl 2
100 mM KCl
1 mM ATP

TE缓冲区（10x）
100mM Tris-Cl
10 mM EDTA（pH 8.0）

吐温-20磷酸盐缓冲盐水（pH7.2）（1L）
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g的Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4
2毫升Tween-20

致谢

感谢Jennifer Gerton博士阅读这个协议。本研究得到了Stowers医学研究所，Cornelia de Lange综合征（CdLS）基金会和3月份的Dimes（MOD）基金会（6-FY14-434）的支持。

参考文献

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Hinnebusch，AG（2005）。eIF2α激酶提供新的解决了底物特异性的难题。 Nat Struct Mol Biol 12（10）：835-838。

Holcik，M。和Sonenberg，N。（2005）。应激和细胞凋亡中的翻译控制。 Nat Rev Mol Cell Biol 6（4）：318-327。

Manche，L.，Green，SR，Schmedt，C.and Mathews，MB（1992）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://mcb.asm.org/content/12/11/5238.short"target ="_ blank">双链RNA调节剂和蛋白激酶DAI之间的相互作用。分子细胞沸腾 12（11）：5238-5248。 >

Nallagatla，SR和Bevilacqua，PC（2008）。 NIPBL控制RNA生物发生以防止应激激酶PKR的激活。细胞Rep 14（1）：93-102。

Zheng，X.和Bevilacqua，PC（2004）。通过具有单链尾的短双链RNA激活蛋白激酶PKR。 10（12）：1934-1945。