材料和试剂

注意：用于制备缓冲液的所有试剂应具有分子生物学级纯度（RNase，不含DNA酶）。水和溶液应在120℃高压灭菌15分钟（苯胺和乙醇除外）

一次性手套
移液器和提示（RNase，无DNA酶或高压灭菌）
Eppendorf管（1.5ml聚丙烯微量离心管，RNase，不含DNA酶或高压灭菌）
纸巾
Corning 50 ml PP离心管（Corning，目录号：430291）
巴斯德移液器
棉签
根据Pelham和Jackson（1976）所述获得或从生物化学供应商处购买的兔网织红细胞裂解物（未经微球菌核酸酶处理）或购自生物化学供应商（例如：Promega，目录号：L4151）
RIP如Barbieri等人所述获得。（2001）或从生物化学供应商购买（例如蓖麻毒素A链：Sigma-Aldrich，目录号：L9514）
碎冰
苯酚/TRIS饱和溶胶，用于分子生物学，稳定化，DNAse，RNAse和无蛋白酶（ACROS Organics，目录号：327125000）
绝对乙醇（EMD Millipore，目录号：100983）
去离子，RNase和无DNA酶的水
注意：例如，Millipore Elix 5（UV）水高压灭菌120°C 15分钟。
苯胺（Sigma-Aldrich，目录号：242284）
尿素（Thermo Fisher Scientifc，Affymetrix，目录号：75826）
过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
丙烯酰胺双丙烯酰胺19：1，40％（w/v）溶液（Thermo Fisher Scientifc，Affymetrix，目录号：75848）
溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E7637）或GelRed（Biotium，目录号：41003）
EDTA·2H 2 O
NaOH颗粒
盐酸（HCl）（EMD Millipore，目录号：100317）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Thermo Fisher Scientifc，Affymetrix，目录号：75819）
乙酸钠三水合物（EMD Millipore，目录号：106267）
冰醋酸（EMD Millipore，目录号：100063）
碳酸二乙酯（Sigma-Aldrich，目录号：D5758）
二乙醚（EMD Millipore，目录号：100921）
三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）（Fisher Scientific，目录号：BP154-1）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
RNA标记（Roche Diagnostics，目录号：1062 638）
注意：本产品已停产。可以由低范围ssRNA梯子替代（New England Biolabs，目录号：N0364S）
溴酚蓝（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0404）
0.5 M EDTA（pH 8.0）（参见食谱）
50mM Tris/0.5％SDS（pH 7.8）（参见食谱）
3 M醋酸钠（pH 5.2）（见配方）
70％乙醇（见食谱）
2 M苯胺（pH 4.5）（见配方）
水饱和醚（参见食谱）
10x TBE缓冲区（见配方）
2x凝胶加载缓冲液（见配方）

设备

（-80°C冰箱）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：TSE系列，目录号：TSE400SSV）}
通风柜（BURDINOLA，型号：V21-Space BAJA ST 1500）
两个微量离心机（DJB Labcare，型号：Heraeus Biofuge Pico，目录号：75003235），其中一个保存在4°C
30℃水浴（JP SELECTA，目录号：6000140）
用于试管的涡街搅拌机（IKA，目录号：0003617000）
BECKMAN DU-640分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU-640）
石英比色皿（Hellma Analytics，型号：104-QS，目录号：104-10-40）
聚丙烯酰胺凝胶电泳系统（GE Healthcare，目录号：80-6418-77）
电源（GE Healthcare，目录号：18-1130-01）
分子成像仪 Gel Doc ^TM XR + System with Image Lab ^{TM软件（Bio-Rad Laboratories，目录号：1708195）}
凝胶染色托盘
磁力搅拌器
高压灭菌器（JP SELECTA，目录号：4002516）

程序

测定N-糖基化酶活性的一般程序如图2中的流程图所示

图2.说明协议的流程图过程部分A-H。流程图显示了描述协议过程的八个主要部分的关键步骤。大写字母（A-H）是指程序部分中的小节。

用RIP处理核糖体
1. 将冻结的兔网织红细胞溶解产物（储存于-80℃）和RIP（储存于-20℃）的冰冻等分试样在室温下解冻，并将其置于碎冰上。
2. 反应在碎冰上制备成四个Eppendorf管，如下所示：
  
  管
  1（控制）
  2（对照）
  3（+ RIP）
  4（+ RIP）
  
  裂解物
  40μl
  40μl
  40μl
  40μl
  
  RIP（1 mg/ml）
  -
  -
  1μl
  1μl
3. 将40μl兔网织红细胞裂解液吸入四管
4. 加入1μl1 mg/ml RIP到3号和4号管中
5. 混合轻轻涡旋。
6. 在水浴中30℃孵育1小时。
7. 加入2μl0.5M EDTA（pH8.0）停止反应
8. 混合轻轻涡旋。
9. 加入500μl50 mM Tris/0.5％SDS。
10. 旋转30秒（目的是在SDS的帮助下使蛋白质变性）。
脱蛋白
注意：此过程应在通风橱下进行。
1. 加入500微升苯酚
2. 涡旋30秒。
3. 在室温下以16,060 x g（13,000rpm）离心5分钟。
4. 将水（上）相（400μl）回收到新的Eppendorf管中，而不会干扰蛋白质相间。

RNA沉淀

为了在1.5ml管中用3体积乙醇进行RNA沉淀，将水相分成两个Eppendorf管（A和B），每个管分别为200μl。通过混合以下方法进行乙醇沉淀：

管	1A（对照）	1B（对照）	2A（对照）	2B（对照）
水相	200μl	200μl	200μl	200μl
3 M醋酸钠，pH 5.2	20μl	20μl	20μl	20μl
绝对乙醇	600μl	600μl	600μl	600μl

管	3A（+ RIP）	3B（+ RIP）	4A（+ RIP）	4B（+ RIP）
水相	200μl	200μl	200μl	200μl
3 M醋酸钠，pH 5.2	20μl	20μl	20μl	20μl
绝对乙醇	600μl	600μl	600μl	600μl

混合混合。
在-80°C（或至少3 h）保持过夜。
在4℃下以16,060 x g（13,000rpm）离心15分钟。定向转子中的每个管，盖铰链指向外部，这将指示颗粒状RNA的位置，因为颗粒几乎不可见。
拿出管子。小心地倒出上清液，弃去纸巾，不会看不见灰白色颗粒，避免其移位。
加入250μl70％乙醇
在4℃下以16,060 x g（13,000rpm）离心15分钟。定向转子中的每个管，盖铰接指向外
仔细倾倒上清液，弃去纸巾，避免颗粒移位。借助棉签去除管壁上的任何液滴。
将管子朝上放在干净的纸巾上，让小球风干15分钟。
将沉淀重悬于10μl无RNase的去离子水中。将管1A和1B以及3A和3B的内容物混合，分别获得20μl的管1和3。将这些样品储存在-80°C。管2A，2B，4A和4B仍然保持分离。

苯胺治疗RNA
1. 向管2A，2B，4A和4B中加入一个体积（10μl）的2M苯胺（pH4.5）。
  注意：反应在碎冰上进行。
2. 混合混合。
3. 在冰上孵育10分钟。
4. 通过加入200μl无RNase的去离子水停止反应，并通过涡旋混合
5. 加入200μl饱和饱和水
6. 涡旋20秒。
7. 让样品放置20秒以允许相分离。
8. 丢弃以太（上）相。
9. 重复步骤D5至D8。
10. 加入20μl3M乙酸钠（pH 5.2）和600μl无水乙醇。
11. 混合混合。
12. 在-80°C（或至少3 h）保持过夜。
13. 在4℃下以16,060 x g（13,000rpm）离心15分钟。定向转子中的每个管，盖铰接指向外
14. 拿出管子。小心地倒出上清液，弃去纸巾，不会看不见灰白色颗粒，避免其移位。
15. 加入250μl70％乙醇
16. 在4℃下以16,060 x g（13,000rpm）离心15分钟。定向转子中的每个管，盖铰接指向外
17. 仔细倾倒上清液，弃去纸巾，避免颗粒移位。借助棉签去除管壁上的任何液滴。
18. 将管子朝上放在干净的纸巾上，让小球风干15分钟。
19. 将沉淀重悬于10μl无RNase的去离子水中。将管2A和2B以及4A和4B的内容物混合，分别得到20μl的管2和4。将这些样品储存在-80°C。
RNA的分光光度定量
1. 解冻冷冻样品1-4，每个20μl，放在冰上。
2. 确定分光光度计中每个样品的RNA浓度为260 nm（石英比色管为10 mm路径长度，以水为空白）。如果A <260> = 1，则RNA浓度为40μgRNA/ml。通常该方法的产量为用苯胺处理的样品为45-50μgRNA，未处理样品为50-60μgRNA。
制备7M尿素/5％（w/v）聚丙烯酰胺凝胶
在不含RNase的Corning管中制备25ml两种凝胶的混合物（10×10.5cm的玻璃板，0.1cm的间隔物）：2.5ml 10×TBE; 3.1ml丙烯酰胺/双丙烯酰胺（40％）; 10.5克尿素; 12.3毫升无RNase的去离子水; 0.2ml 10％过硫酸铵; 0.05 ml TEMED。
样品的制备
将样品制成放在碎冰上的Eppendorf管
1. 加入3μgRNA
2. 用水完成体积至5μl。
3. 加入5μl2x凝胶加载缓冲液
4. 混合混合。
5. 煮沸30秒（在100°C水浴中），立即将管放在碎冰上。
电泳
1. 将凝胶板连接到凝胶装置上
2. 将TBE电泳缓冲液（900 ml水和100 ml TBE）加入顶部和底部室
3. 取出梳子并用缓冲液冲洗孔以除去残留的尿素（使用巴斯德吸管）。
4. 使用微量移液器，装载样品。
5. 运行凝胶在15毫安1小时50分钟
6. 拆解凝胶。
7. 用0.5μg/ml溴化乙锭或GelRed溶液在室温下将凝胶染色40分钟，轻轻摇匀（染色后不需脱色）。
8. 将凝胶放在紫外线透射仪上。可视化和拍摄RNA带。
  注意：请注意，RNA会在凝胶内随时间扩散，因此检查和摄影应在电泳结束后不久进行。
  代表性数据如图3所示
  
  图3. BE27在兔网织红细胞裂解物中的rRNA N-糖基化酶活性。每个泳道含有从未处理（对照）或RIP（+ BE27）处理的来自兔的核糖体分离的3μgRNA。箭头表示28S，18S和5.8S rRNA，并且在苯胺处理（+）后作为RIP作用的结果释放RNA片段。指示A部分中对应的管的数量。将泳道5和6的样品分别作为泳道3和4的样品进行处理，但用3μg而不是1μg的BE27处理核糖体。也表示核苷酸中RNA标记的大小（M）。左侧的凝胶用溴化乙锭染色，凝胶右侧用GelRed染色。

数据分析

该方法对于鉴定rRNA N-糖基化酶活性非常特异，结果非常可靠。包括对照以排除通过苯胺处理随机产生的非特异性RNA断裂。另一方面，在每个实验中进行在不存在和存在苯胺的RIP处理的rRNA的比较分析，以排除由于可能的片段或降解RNA的可能污染物引起的非特异性效应。此外，可以通过用不同RIP浓度处理RNA来确认结果。 RNA分子量标记可用于确定释放的RNA片段的大小（其取决于测定中使用的核糖体的类型）。还建议在实验中包括以前发布的RIP（例如，蓖麻毒素），以明确地定位片段。

笔记

由于其敏感性和简便性，兔网织红细胞裂解物是检测rRNA N-糖基化酶活性的最佳系统。该方法也可用于测试特异性RNA酶活性（α类似刺激样活性），但不用苯胺处理。其他敏感核糖体也可以轻微修改使用，但由于在凝胶电泳后可以看到许多RNA条带，因此在检测到Endo的片段之前需要进行优化。已经使用这种修饰的方案成功地用于酵母，青霉菌，大肠埃希氏菌，根癌土壤杆菌，绿链球菌（Streptomyces lividans），乳酸发酵短杆菌，Vicia sativa，和Colo 320和HeLa细胞培养物。

食谱

0.5 M EDTA（pH 8.0）
1. 加入186.1g EDTA·2H 2 O二钠至800ml的ddH 2 O -/-
2. 用磁力搅拌器剧烈搅拌
3. 用NaOH（约20g NaOH颗粒）将pH调节至8.0
4. 通过高压灭菌将其分配至等分试样并灭菌
注意：通过加入NaOH将溶液的pH调节至〜8.0之前，EDTA的二钠盐不会进入溶液。在120°C高压灭菌15分钟。
50 mM Tris/0.5％SDS
混合45ml ddH 2 O，2.5ml 1M Tris-HCl（用HCl调节至pH 7.8）和2.5ml 10％SDS。高压灭菌器120°C 15分钟
3 M醋酸钠（pH 5.2）
20.412克醋酸钠三水合物
加入约6毫升冰醋酸至pH 5.2，并加入高达50ml的ddH 2 O→/ 在120°C高压灭菌15分钟
70％乙醇
70％乙醇绝对和30％去离子，RNase和无DNA酶水
2 M苯胺（pH 4.5）

将18.25毫升苯胺加入RNase和无DNA酶的水中
使用无RNA酶的电极用冰醋酸调节至pH 4.5，用RNase和不含DNA酶的水或用1％的焦碳酸二乙酯在水中洗涤。
加入双蒸水至100 ml
在Eppendorf管中分装，储存于-20°C

水饱和醚
将一体积的去离子，RNase和无DNA酶的水加入一体积的乙醚中并混合。上层是水饱和醚
注意：在通风橱下，室温下储存少量（10ml）。
10x TBE缓冲区

溶解（使用磁力搅拌器）将108g Tris碱和55g硼酸溶于800ml去离子，RNase和无DNA酶的水中。
加入40 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）
将音量调整为1 L
在120°C高压灭菌15分钟
在室温下存放

2x凝胶加载缓冲液
TBE缓冲区
100毫克/毫升蔗糖
7 M尿素
0.4μg/ml溴酚蓝
储存于4°C直至使用

致谢

该协议是从以前的出版物（Endo和Tsurugi，1988; Sallustio和Stanley，1990）中修改的。这项工作得到了BIO39/VA39/14和BIO/VA17/15授权给L.C.的支持。

参考文献

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Sallustio，S.和Stanley，P.（1990）。中国仓鼠卵巢核糖体突变体的分离对蓖麻毒素，相思豆毒素和新霉素具有差异性抗性。生物化学265（1）：582-588。