材料和试剂

PrecisionGlide针头23 G（BD，目录号：305111）
PrecisionGlide 26 G（BD，目录号：305193）
60×15mm培养皿（Corning，Falcon ^®，目录号：351007）
50ml旋转锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：362696）
10ml Luer滑点注射器（Fisher Scientific，目录号：14-841-55）
剃刀刀片
组织培养板
100微米尼龙丝网（尼龙网实验室包装）（Sefar，目录号：7050-1220-000-20）
MACS LS栏（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
15ml锥形离心管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352097）}
1毫升滑点注射器（BD，目录号：309659）
0.22μm过滤器（Millipore Express PLUS0.22μmPES）（EMD Millipore，目录号：SCGPU01RE）
移液器提示
乳胶手套
注射器盖帽（BD，目录号：305819）
小鼠
70％乙醇
磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
热灭活的胎牛血清（Mediatech，目录号：35-010-CV）
青霉素 - 链霉素100x（Mediatech，目录号：30-002-CI）
L-谷氨酰胺100x，200mM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，25030-018）}
两性霉素B（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15290018）
Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（Lonza，目录号：12-604F）
胶原酶A（Roche Diagnostics，目录号：10103578001）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：D4263）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：254134）
碳酸氢钾（KHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：431583）
EDTA，0.5M（Lonza，目录号：51201）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3912）
Percoll（Sigma-Aldrich，目录号：P1644）
鼠标CD11c MicroBeads UltraPure（Miltenyi Biotec，目录号：130-108-338）
台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15250061）}
完整的媒体（见配方）
胶原酶消化液（参见食谱）
RBC裂解缓冲液（参见食谱）
无血清培养基（见食谱）
MACS缓冲区（见配方）

设备

CO ₂ tank
剪刀
镊子
水浴
细胞培养箱
摇杆
冷藏摇摆式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-12R）
涡流
血细胞计数器
鼠标限制器
加热灯
移液器
复合显微镜
MACS分隔符（Miltenyi Biotec）

程序

从供体小鼠的肺中制备单细胞悬液
1. 用CO 2安乐死小鼠。切割肋骨以暴露心脏和肺部（图1A和1B）。
2. 为了从肺中清除血细胞，使用23号针头通过心脏的右心室，用3-5ml PBS灌注肺（图1C）。轻轻注射PBS直到肺的颜色变成白色。请注意，发炎或受伤的地区，灌注发生红斑。
3. 消除肺叶（总共5只，每只小鼠，图1D），并将它们放在一个60 x 15毫米的陪替氏培养皿中，约1毫升冷PBS，并储存在冰上，直到所有的小鼠都收获所有的肺。
4. 从PBS中取出肺，用剪刀将培养皿盖在培养皿的盖子上，直到苹果酱的一致性;保持每只小鼠的肺分开（图1E）
  
  图1.准备肺组织 A.将安乐死的小鼠放在塑料泡沫板上。 B.切割肋骨以暴露心脏（H）和肺（L）。 C.通过将PBS注射到心脏的右心室来灌注肺。黑色箭头指向插入心脏的针头。 D.将肺叶（5）取出并放入含冷PBS的培养皿中。 E.肺切碎。
5. 用15ml胶原酶消化液冲洗剪刀和培养皿（参见下面的配方），并放入50ml圆锥形离心管中。
6. 关闭管，并在37℃水浴中孵育管5分钟，然后在37℃的摇床上孵育30分钟。
7. 使用10ml滑点注射器，上下抽取样品20次以分散细胞。
8. 在摆动式离心机中以200×g离心10分钟（即1,000rpm）离心10分钟。
9. 吸出上清液并弃去;通过轻轻涡旋分解沉淀物
10. 每个样品加入3 ml冷RBC裂解缓冲液（NH 4 Cl，见下面的配方）以裂解红细胞，在冰上孵育2-3分钟。
11. 向每个管中加入10ml冷的完整培养基（参见食谱）以在4℃下以200×g×10分钟再次停止裂解并沉淀。
12. 吸出上清液，分离沉淀，加入5ml无血清培养基（参见食谱）重悬细胞。
13. 用剃须刀切开尖头，将其放在10毫升滑点注射器上（这是为了使注射器针头稍长一点，以便分散体积小于5毫升。将样品上下抽取20次以分散细胞。
14. 将溶液吸入注射器，并通过无菌的100μm尼龙筛网进行过滤。用另外5毫升完整的介质冲洗屏幕。
15. 在完整培养基中加入10 ml 40％Percoll。通过将管倒置5次并以1,800 x g（即，3,000rpm）离心20分钟，将制动器关掉。
16. 吸出上清液并弃去;用10ml完整培养基分解沉淀。在血细胞计数器上计数细胞与台盼蓝排除。
  注意：我们通常会恢复16-17万个细胞/天真的老鼠。
肺APC浓缩
注意：在我们手中，肺APCs的产量通常为肺单细胞悬液中总细胞的5％。人们可以粗略地计算起始的总肺细胞数，以获得足够的肺APC用于他/她的实验。
1. 在200×g离心单细胞悬浮液10分钟并吸出上清液并弃去。
2. 将细胞沉淀重悬于400μl冷MACS缓冲液（参见食谱）中，小于或等于10μg/ml总肺细胞，并加入100μlCD11c MicroBeads。如果超过10个总细胞，请放大缓冲液和珠子。
3. 混合均匀，并在冰箱（2-8℃）中孵育15分钟。请注意，在冰上工作可能需要较长的孵化时间。
4. 用10ml冷MACS缓冲液/10 8细胞洗涤细胞，并在4℃以200×g离心10分钟。
5. 吸出上清，然后将细胞沉淀重悬于500μlMACS缓冲液中。
6. 将列放在MACS LS列的磁场中。用3ml MACS缓冲液冲洗准备柱。
7. 在柱上放置无菌的100μm尼龙筛网。通过尼龙筛网过滤，将细胞悬浮液施加到柱上。在15 ml锥形离心管中收集含有未标记细胞的流通。
8. 用3ml MAC缓冲液洗涤柱并收集未标记的流通池。洗3次。
9. 从分离器中取出柱，并将其放在新的15 ml锥形离心管上。
10. 移取柱上的5ml缓冲液。通过将柱塞牢固地推入柱子中，立即将磁性标记的细胞冲洗掉。
11. 将离心浓缩的CD11c ⁺细胞在200×g下10分钟，弃去上清液。
12. 通过用10ml无血清培养基轻轻分解沉淀物来洗涤细胞。在血细胞计数器上计数细胞与台盼蓝排除。注意，通常恢复1-2百万APC /鼠标。
13. 以200μg离心10分钟并弃去上清液。将细胞重悬于适当体积的无血清培养基中，以达到每200μl终浓度为1×10 6个细胞。
通过静脉内注射将肺APCs转移到接受者中注意：通过气管内给药也可以实现继发性转移（气管内给药的详细方案请参见Ortiz-Muñoz和Looney，2015，Bio-protocol）。
1. 将称重传感器悬浮液装入带有26 G针头的1 ml注射器中。确保清除气泡。
2. 将收件人的鼠标放在塑料鼠标限制器中，并用加热灯将尾巴加热约1分钟（图2A）。
3. 用温和的牵引力固定尾巴（图2A）。
4. 用70％乙醇喷洒尾巴以显示侧尾静脉，并旋转尾巴¼转，便于注射。
5. 在尾部的远端部分，将平行于静脉的针2〜5mm插入内腔（图2B）。
6. 以每只小鼠200μl注射1×10 6个细胞。缓慢注射细胞悬浮液。如果针头正确定位，细胞悬液应该容易流动。
  
  图2.尾静脉注射 A.将受体鼠标放置在限制器中。 B.将针头插入小鼠尾静脉注射细胞
7. 取出针头并施加压力以防止出血。
8. 将收件人的老鼠放回笼子里。
9. 然后，小鼠可以接受指定的治疗，并可在适当的时间点进行分析。

数据分析

在5×10 4 pfu /小鼠的剂量下感染鼠γ疱疹病毒68（MHV-68）三天后，从C57BL/6小鼠的肺制备单细胞悬液（Zhou， em> et al。 2016）。然后通过使用抗小鼠CD11c微珠来浓缩CD11c ⁺细胞。为了通过流式细胞术分析这些富含微细胞的细胞的组成，使用合适的荧光偶联抗体染色细胞表面标志物。每个地块的百分比代表每个家长门的百分比。在两次额外的独立实验中获得了类似的结果。大多数富集的CD11c ⁺ APCs是肺泡巨噬细胞（AM）（CD45 ⁺ CD11c ^{+//> MHC II ^{sup> hi}）和DC。 DC群体可以进一步分离成CD103cDC（CD45cCDC），CD11c ^{+//> MHC II} CD64} （CD11b ^int），CD11b ⁺ cDCs（CD45 ⁺ CD11c ⁺ MHC II < （CDCD） CD103 CD103 CD103 > + MHC II CD64 ⁺ CD103 ^lo CD11b ^hi）（Misharin et al。，2013; Wang等人，2006）（图3）。
在MHV-68感染后3天，从同源CD45.1小鼠制备肺APCs，并过继转移到野生型C57BL/6小鼠（CD45.2，CD45.1， - ）。接受者在细胞转移后24小时感染MHV-68，并在细胞转移48小时后安乐死用于流式细胞术分析。代表性的流式细胞术图显示供体CD45.1 ⁺ APCs在肺，肺引流淋巴结（dLN）和CD45.1 接受者的脾脏（图4）。 br />

图3.从小鼠肺分离的APC的代表性流式细胞术图

图4.跟踪注入的细胞。上面，没有细胞转移的野生型C57BL/6小鼠;下盘，野生型C57BL/6受体通过CD45.1 肺APC继续转移。

笔记

如果CD11c ⁺亚群正在研究中，则可以用合适的荧光结合抗体进一步染色磁性富集的细胞，并使用荧光激活细胞分选（FACS）（Misharin et al。 al 。，2013）。

食谱

完成媒体
混合以下溶液并通过0.22μm过滤器过滤：
50ml热灭活胎牛血清 5 ml 100x青霉素 - 链霉素（10,000 IU青霉素和10,000μg/ml链霉素）
5ml 100x L-谷氨酰胺（200mM）
0.5ml两性霉素B（250μg/ml）
将过滤后的混合物加入到500ml DMEM培养基中
胶原酶消化液（每只鼠，使用前立即准备）
15毫克胶原酶A
0.25 ml DNase I（250 Kunitz单位）
15毫升完整媒体
RBC裂解缓冲液
将以下物质溶解在800ml蒸馏水中的二氧化O O O。。 8.3g NH 4 Cl
1.0克KHCO 3
1.8ml 5％EDTA
加入蒸馏的H 2 O 2，总体积为1000ml
过滤器通过0.22μm过滤器灭菌，并保存在冰箱中
血清免费媒体
500毫升DMEM培养基
5 ml 10％BSA
5 ml 100x青霉素 - 链霉素（10,000 IU青霉素和10,000μg/ml链霉素）
5ml 100x L-谷氨酰胺（200mM）
0.5ml两性霉素B（250μg/ml）
储存在冰箱（4-8°C）
MACS缓冲区
150 ml溶液：
7.5毫升10％牛血清白蛋白（BSA）
0.6ml 0.5M EDTA 储存在冰箱（4-8°C）

致谢

这个协议是从我们的出版物（Zhou等人，2016）改编而成。这项工作得到NIH授权AI117229，HL115618，T32HL07749和2UL1TR000433的支持。

参考文献

Becher，B.，Schlitzer，A.，Chen，J.，Mair，F.，Sumatoh，HR，Teng，KW，Low，D.，Ruedl，C.，Riccardi-Castagnoli，P.，Poidinger， Greter，M.，Ginhoux，F.and Newell，EW（2014）。鼠骨髓细胞系统的高维分析。 Nat Immunol 15（12）：1181-1189。
Kopf，M.，Schneider，C.and Nobs，SP（2015）。肺驻极体巨噬细胞和树突状细胞的发展和功能。免疫学杂志 16（1）：36-44。
Misharin，AV，Morales-Nebreda，L.，Mutlu，GM，Budinger，GR和Perlman，H。（2013）。小鼠肺中巨噬细胞和树突状细胞亚群的流式细胞术分析。 Am J Respir Cell Mol Biol 49（4）：503-510。
Ortiz-Muñoz，G. and Looney，MR（2015）。小鼠无创气管内滴注。生物方案5（12）：e1504。
Wang，H.，Peters，N.，Laza-Stanca，V.，Nawroly，N.，Johnston，SL and Schwarze，J。（2006）。本地CD11c ⁺ MHC class II ^-前体在呼吸过程中产生肺树突状细胞病毒感染，但在此过程中耗尽。 J Immunol 177（4）：2536-2542。
Zhou，X.，Loomis-King，H.，Gurczynski，SJ，Wilke，CA，Konopka，KE，Ptaschinski，C.，Coomes，SM，Iwakura，Y.，van Dyk，LF，Lukacs，NW和Moore，BB （2016）。骨髓移植改变肺抗原呈递细胞促进TH17反应，以及伽pes病毒感染后肺炎和纤维化的发展。粘膜免疫学9（3）：610-620。