材料和试剂

导管胶带（例如，，Tesa，通用额外功率）
50ml Falcon管（例如，SARSTEDT，目录号：62.559.001）
15ml Falcon管（例如，，SARSTEDT，目录号：62.554.502）
2ml反应管（例如，SARSTEDT，目录号：72.695.500）
0.3ml有限体积的插入物（例如，Brown，目录号：155650）
热胶
硅酮化合物（例如，RS Components，目录号：692-542）
（例如，SARSTEDT，目录号：72.690.001）
蛋白质测定法（例如，Pierce BCA试剂盒，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，商品名：23225）
乳胶乳，60％，低氨（例如，Weber& Schaer，Hamburg，目录号：RSS LA）
已知浓度的纯化橡胶加氧酶，Lcp或RoxA
用于HPLC的甲醇（例如，VWR，目录号：20864.320）
乙酸乙酯（例如，Carl Roth，目录号：7338）
氮气
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（例如，Carl Roth，目录号：3904）
磷酸二钾（K 2 HPO 4）（例如，Carl Roth，目录号：6875）
Nonidet P-40（例如，Sigma-Aldrich，目录号：74385）
磷酸钠缓冲液（KP），例如100mM，pH7（参见食谱）
Nonidet P-40溶液（见配方）
天然橡胶乳胶（见食谱）
稀释胶体胶乳缓冲液（见配方）

设备

Oxy-4迷你变送器（PreSens，目录号：200000767）
夏普剪刀
吸收细胞（比色皿），半微量，光路径10mm，体积1,400μl，光学特殊玻璃，4片（例如，Hellma分析，目录号：114-10-20）
比色杯架16×1厘米（例如，Carl Roth，目录号：CNP5.1）
氧传感器点SP-PSt3-NAU-D5-YOP（PreSens，目录号：200000023）
3 mm电钻
导光电缆（2.5m，4片，POF-L2.5-1SMA）（PreSens，目录号：200000241;手册中指定为"聚合物光纤"）
冷冻储存盒（例如，，Greiner Bio one International，目录号：802 202）
磁性微型搅拌器5×2mm，4片（例如，Carl Roth，目录号：0955.2）
离心机（例如，Eppendorf，型号：5417C）
高压灭菌器
耐热容器
移液器
烧杯
HPLC（例如，Agilent Technologies，型号：Agilent 1100系列; 210nm处的DAAD检测器）
LiChrospher 100 RP-8 5μm封端的HPLC柱（例如，Trentec，目录号：124LP-85ER，用于该测定;或者EMD Millipore，目录号：150827）
HPLC玻璃小瓶（例如，Brown，目录号：155710）
烟柜
实验室温度计（例如，，VOLTCRAFT，型号：DET1R）

软件

Oxy4 V2（Presens，雷根斯堡，德国）
Excel（Microsoft，Redmont，USA）
化学工作站用于LC 3D系统（Agilent Technologies，Waldbronn，德国）

程序

注意：确保妥善考虑处理危险化合物和废物管理的所有安全说明;因为这些在不同的国家可能会有所不同，以下协议不会就这些问题提供任何指导。

第一部分。氧气消耗测定

在溶液中，可以实时监测氧浓度，并允许氧化酶的生化表征。在这里，我们描述了一种分析橡胶加氧酶如橡胶加氧酶RoxA或胶乳清除蛋白（Lcp）对橡胶（聚异戊二烯）的氧化裂解的分析。

准备
1. 根据各制造商提供的说明准备氧气监测仪器。（例如，，PreSens Oxy-4-mini， https://www.presens.de/products/o2/meters.html ）
2. 传感器点被光激发，因此在不使用时应保持在黑暗环境下长时间存放，否则反应性和灵敏度会降低。
3. 使用锋利的剪刀切割传感器的形状。不要切割太多，以确保表面尽可能大，但仍适合比色杯，这里〜4 x 5毫米。使用长而细长的钳子进入比色皿。
4. 注意传感器光点的方向，在PreSens光斑的情况下，红色面与硅化合物和反应杯的玻璃壁接触，而黑色侧面表示内部并与反应混合物接触。请勿将硅胶复合物置于传感器的黑色反应端
5. 将一个传感器点胶粘到每个比色皿的内表面上方5毫米以上。按照制造商的指示使用指定的硅胶。有关视频，请参阅： http://www.presens.de/support/presens-tv/how-to/o2-spot-integration-part1-glassvials.html 。在黑暗中室温干燥过夜。准备四个比色皿，比较图1.
  
  图1.氧气监测比色皿。每个比色皿的总体积为1.4 ml。如上所述，将PreSens氧传感器点（红色）切割并胶合到位。
6. 为了将光缆与传感器光点对准，使用自制的改进的比色皿支架，这是不可商购的。装配说明：
  1. 在中间切割16槽样气瓶架（给两个相等的一半）。
  2. 用胶带密封四个前槽的底部。
  3. 用热胶水填充空腔，等待胶水固定。
  4. 切掉四个剩余插槽的底部（见图2），使比色皿完全适合。
  5. 使用3毫米的电钻从比色杯架的前面向后钻一个孔注意：注意不要弯曲导光电缆，否则可能会损坏并变得功能失调。
  6. 插入导光电缆，使电缆的接口与比色皿中的传感器光点正确对齐，比较图2.
  7. 使用一滴热胶将光导电缆抵抗机械应力固定在比色杯架上。
  8. 重复此过程准备四个插槽。
  9. 要完成设备，将准备的块粘在冷藏储藏盒的盖子上，作为导光电缆的应变消除。
  10. 现在您的设备应该与图2所示的设备相当。
  11. 完成后，将设备放置在磁力搅拌单元上，并将其设置为〜750 rpm，将试剂溶液与每个比色皿中的磁性微型搅拌器（5 x 2 mm）混合。
    
    图2.完成的比色皿支架的图像，用于将传感器光点与导光电缆粘合到比色皿中。将设备放置在磁力搅拌装置上以混合反应。 />
    
    这个简单而便宜的测量站已经建立，因为据我们所知，没有小规模的测量船可用;此外，在蛋白质测定中，通常只有非常少量的样品可用，我们的设置可节省试剂和酶。或者，可以使用聚碳酸酯块并将空腔研磨到块中或使用3D打印机来组装比色皿固定器。组装可以轻松调整另外数量的比色杯。也可以使用其他变体和大小的比色皿进行测定。
测量氧气消耗量
1. 蛋白质浓度测定
  1. 通过合适的方法，例如使用Bradford测定法，BCA测定法，或者如我们的实例，通过已知的特异性的光谱法确定在该测定中要表征的加氧酶的蛋白质浓度含有橡胶加氧酶的血红素消光系数。
    例如：LCPK30蛋白质浓度c
    的光谱测定 412 = 412 xcxd或c = E 412 412 -1×d-1
    哪里，
    ε412范围：Lcp K30的消光系数，80,000M ×cm [L mol ^-1 cm ^-1]在412 nm
    在412nm处光谱测定的吸光度[无单位]
    d：比色杯的路径长度，通常为1厘米 L30 K30分子量〜43,400Da = 43,400g×mol ^-1
  2. 实验数据：用适当稀释度的路径长度为1厘米的比色皿中的光度计测量您感兴趣的蛋白质的灭绝;在以下实施例中，对于纯化的LCP K30 溶液的1:10稀释度记录了在412nm处的消光值为0.5。
    412 = 0.5;稀释= 1:10，路径长度= 1厘米
  3. 计算：
    c = 0.5/80,000×1 [M×cm/cm] = [M]
    c = 0.5/80 [mM] = 500/80 [μM] =6.25μM
    1 M Lcp K30 = 43,400g/L
    1μMLcp K30 = 0.0433g/L = 43.3mg/L
    6.25μMLcp K30 = 271.6mg/L，由于蛋白质为1:10稀释，未稀释的蛋白质溶液的浓度为2716mg/L或〜2.7mg/ml
2. 洗乳胶乳
3. 稀释胶体胶乳缓冲液的制备
  1. 为了用于氧气消耗测定，将空气饱和的磷酸钾缓冲液（KP，参见食谱）稀释至0.2％wt/vol，在所需的pH（通常为pH7）下。例如，将6ml KP缓冲液移液到15ml Falcon管中，并在Nonidet溶液中加入20μl洗涤的天然橡胶胶乳，倒置5次。
  2. 将缓冲液稀释的胶乳乳液孵育直到达到期望的温度（例如室温，23℃）;或者，整个系统可以放置在具有升高的温度（例如30℃）的房间中。这是重要的，因为氧饱和度取决于温度。
4. 测量氧饱和度的预先设置。
  1. 将500μl新鲜制备的稀释胶体胶乳缓冲液吸入每个比色杯。
  2. 加入磁力搅拌棒，以750rpm混合乳液
  3. 平衡2分钟
5. 操作软件
  1. 启动监控程序，在我们的例子中，我们使用"oxy4v2"通过变送器oxy4-mini测量比色皿中的溶解氧浓度。
6. 校准
7. 数据记录
8. 测量设置
9. 执行测量
10. 设备的终止和清理
抑制剂研究
该测定允许根据氧饱和度的测量快速且容易地测定酶活性。可以比较不同的酶，突变蛋白，或调查潜在的抑制剂的作用。例如，0.1％SDS抑制Lcp的氧消耗。

第二部分。基于HPLC的橡胶裂解产物的分离

在发生氧化聚异戊二烯裂解之后，可以从反应混合物中提取所产生的低聚异戊二烯，随后通过HPLC分离以进行如下所述的分析。

准备

根据制造商提供的说明设置HPLC装置，并安装RP-8反相柱。
去离子水。
供应水为第一流动相，甲醇为第二
在23°C下计算流速为0.7 ml/min。
计划每次运行20μl样品的注射体积。

编制溶剂梯度：

分>	水（％）	甲醇（％）
0-5	50	50	isocratic
5-25	0	100	渐变
25-35	0	100	isocratic
35-36	50	50	渐变
36-40	50	50	isocratic

氧化聚异戊二烯切割测定
1. 标记2 ml反应管，并将它们放在架子上
2. 移取700μl稀释的胶体胶乳缓冲液（0.2％，见第一部分，步骤B3），并调节温度。
3. 如果适用，将所需浓度的抑制剂加入溶液中
4. 添加指定量的酶，通常最终浓度为4μg/ml
5. 孵化混合物，盖子在所需的温度下打开，通常为聚异戊二烯切割2小时，每30分钟轻轻一摇。
6. 一定要准备一个没有酶的空白，同样对待。
低聚异戊二烯的提取
1. 在使用乙酸乙酯或甲醇时，在附近没有点火源的烟雾柜内工作。
2. 向每个含有700μl反应体积的管中加入1,000μl乙酸乙酯
3. 关闭盖子并旋转管子20秒，白色胶乳会凝结
4. 在室温下以20,000×g离心所有管2分钟。
5. 根据测定标记1.5ml管，并小心地去除900μl上溶剂相，以避免混合和溢出。丢弃2 ml管。
6. 将乙酸乙酯在烟气柜中完全蒸发过夜，或者以〜0.2L/min小心地用氮气冲洗加强蒸发。
7. 向管中加入100μl甲醇，并通过将溶液上下吸取5次冲洗1.5ml管的壁以溶解切割产物。将甲醇 - 产物溶液转移到补充有0.3ml小容量插入物的HPLC玻璃小瓶中，并将其拧在盖子上
8. 应用所有样品进行HPLC分析。

数据分析

第一部分氧气消耗测定

评价
1. 氧浓度的测量非常敏感，但也容易出现几个因素
2. 由于氧气的温度和压力依赖的溶解度，必须在恒定温度下进行测量并且相对于压力进行分析。然而，大气压力的微小变化在方法的误差范围内。
3. 该方法的长期实用性表明，每个实验应重复三次，获得六项测量数据
4. 用四个比色皿进行常规测定如下：
  1. 空白无酶。
  2. 野生型作为参考。
  3. 突变蛋白样品A.
  4. 突变蛋白样品B.
  三个重复对应于突变蛋白和3个基线文件的6个文件以及野生型蛋白的3个数据集作为参考，需要彼此之间的样本的统计相似性（平均值±3×标准偏差）。
特定酶活性的计算
1. 完成描述的氧气监测后，* .csv格式的文本文件将自动保存在指定位置的每个通道。
2. 它包含有关氧量计和所选参数设置的信息的摘要。该分析的兴趣结果以分号（;）分隔的数据集记录。
3. 以合适的计算软件，例如，MS Excel。
  打开* .csv文件
4. 选择第一列，然后按选项卡"数据"。选择"文本列"。选择"分离"并选择分号（;）作为分隔符。这应该将第一列分成几列，每个参数一列。
5. 为了分析耗氧量，只有两列是令人感兴趣的。时间为x轴，"Oxy /％空气坐"为y轴。将两列提取到新的电子表格中。
6. 重复这些步骤处理所有通道的数据，并将值粘贴到电子表格中。
7. 在新的电子表格中，使用带有线选项的X-Y散点图绘制图形。该图应该与使用oxy-4v2软件的测量过程一样。
8. 由于我们使用空气饱和的稀释的胶体胶乳缓冲液将氧饱和度校准为100％，所以在加入酶之前，基线的测量值在100％的范围内。此后，酶反应引起的氧气减少是可见的，我们使用线性降低的斜率来计算特定的酶活性。
9. 为了通过线性回归确定斜率，最简单的方法是将线性减少的数据复制到同一图中的新系列中。对于这一行，我们使用'趋势线'特征来计算斜率。指定"线性"，并选中框以显示公式，并确定合适的系数（1表示最适合）。斜率的单位为％O 2 min ^-1。
10. 在23℃和1,013毫巴下，1L空气饱和的稀释的胶体胶乳缓冲液含有〜8.3mg O 2。这相当于259μmolO 2％= 100％。因此，氧饱和度降低1％对应于〜2.6μmol二氧（2.6μmol％^-1）
11. 为了计算摩尔氧消耗速率，乘以计算的斜率和因子：2.3％min ^-1x2.6μmol％^{-1.0μmol/min}。该值对应于0.5ml体积的比色杯中的1L的体积并且等于3.0nmol min ^-1。
12. 为了确定具体的酶活性，将摩尔耗氧量除以用于测定斜率的酶量，在这种情况下为2μg，得到1.5nmol/min的蛋白质 - 1 或1.5μmolmin ^-1 mg ^{-1（对应于1.5U/mg）。}
13. 在23℃下野生型Lcp K30（Lcp来自链霉菌属菌株K30）的比活性为1.5U/mg（Watcharakul等人，与另一组（Hiessl等）研究的来自Gordonia polyoprenivorans菌株VH2（Lcp VH2）的同源物Lcp测定的1.3U/mg相关联，2014）。
14. 对所有测量重复此评估，重复的值应在标准误差的范围内。
  注意：在初始恒定下降后，氧浓度的降低通常会减慢（图4）或者再次稍微增加。这可以通过将氧扩散到（未密封的）测定缓冲液中来解释。如果您希望在较长时间内监测氧气消耗率，则必须密封比色皿，或者应使用较大体积的测定混合物。
  
  图4. LcpK30的比活性的实施例计算。在该实验中，使用1ml的测定体积。测量时间（X）和氧饱和度（Y）的值，如从所得到的* .csv文件所描述和提取的那样进入电子表格。数据在X-Y散点图中可视化。在12分钟后添加酶导致在聚异戊二烯裂解过程中掺入二氧氧化碳降低了氧饱和度。斜率可以拟合并与酶活性成正比。通过将比例因子乘以除以测量中使用的酶量，可以如所述计算特异性酶活性。

第二部分基于HPLC的低聚异戊二烯分离

在通过HPLC分析每个样品后，可以使用适合的软件（在我们的安捷伦化学工作站）中评估报告文件。

对于数据处理，仅通过从每个结果中减去没有酶的空白运行的简单基线校正就足够了。成功分析的一个例子如图5所示。
根据其在该测定中的相应保留时间，峰的鉴定是可能的。以前的研究（Braaz等人，2005; Birke和Jendrossek，2014），使用HPLC MS分析鉴定了相应的寡聚异戊二烯分子。
通过计算峰面积和通过与已知活性和浓度的均等处理的酶进行比较来确定相对活性，可以进行定量
对于RoxA蛋白质，通常只检测到一种主要降解产物（n = 2）。相比之下，Lcp将橡胶切割成各种具有不同数量（n）异戊二烯单元的寡聚异戊二烯（图5）。

图5.在没有酶的空白运行之后减去Lcp（黑色）和RoxA（红色）衍生的切割产物的HPLC色谱图。产生的寡聚异戊二烯产物的配方显示在右上角。裂解产物中异戊二烯单元的数量由所标识峰的n值表示。

食谱

磷酸钠（KP）缓冲液

分别制备100mM KH 2 PO 4和K 2 HPO 4的溶液
混合两种溶液以调节所得KP缓冲液的pH值，通常为pH 7.0
为了制备pH7混合物的缓冲液，将5体积的碱性K 2 HPO 4 O 4溶液与4体积的酸性KH 2 PO 3 > 4 解决方案

Nonidet P-40解决方案
向去离子水中加入0.1％wt/vol的洗涤剂
天然橡胶乳胶
如上所述进行准备（步骤Ⅰ，步骤B2）
稀释胶体胶乳缓冲液
准备如上所述（程序第一部分，步骤B3）

致谢

我们感谢德国Forschungsgemeinschaft（DFG Je152/17和Je152/18）为德国PreSens，德国，韦伯和德国Schaer以及德国IBA生命科学公司提供资金，分别提供传感器点，聚异戊二烯胶乳和Strep-Tactin色谱柱。

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