材料和试剂

石蜡膜
奶酪布
从建筑或农业市场获得的细砂（洗涤和筛分），在120℃下高压灭菌30分钟
铝箔
聚苯乙烯盘（厚度10毫米）
F。禾本科分离'IFA 65'（自然资源与应用生命科学大学，农业生物技术系，奥地利维也纳）
合成营养琼脂培养基"SpeziellerNährstoffarmerAgar（SNA）"（Leslie and Summerell，2006）
吐温-20（Carl Roth，目录号：9127）
MENNO花卉（MENNO CHEMIE Norderstedt）
次氯酸钠溶液（Carl Roth，目录号：9062）
Wuxal超级（曼纳，杜塞尔多夫）
液氮
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（Sigma-Aldrich，目录号：P6685）
FastStart Universal SYBR Green Master（Roche Molecular Systems，目录号：04913850001或04913914001）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）<>>
硝酸钾（KNO 3 ）
七水合氯化镁（MgSO 4·7H 2 O）
氯化钾（KCl）
葡萄糖
蔗糖
琼脂
合成营养不足琼脂（SNA）（见食谱）

设备

气候室为20°C，在冷白光和近紫外光照射下，用于制备真菌培养物
血细胞计数器
光学显微镜（Zeiss）
磁力搅拌器
气候室，白天/晚上为22°C/18°C，植物栽培湿度为60％。
平托盘
旋转振动筛
锅（7.5 x 7.5 x 8.0 cm）
NanoDrop ND 1000（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop ND 1000）
ABI Step One Plus实时PCR系统（Applied Biosystems）

软件

PSS 20（IBM SPSS Statistics 20; IBM Corp.，USA）

程序

F的准备。 graminearum macroconidia暂停
1. 将大分子悬浮液在-80℃下储存在无菌双蒸水中作为储备溶液
2. 为了制备接种的大分子悬浮液，将15μl储备溶液转移到合成营养缺乏的琼脂（SNA）上，并在20℃下在冷白光和近紫外光照下进行培养。使用石蜡膜密封琼脂板。还请考虑议定书末尾给出的关于真菌侵略性的说明1。
3. 9日龄的真菌殖民地已准备好收获大分子植物。 SNA是一种营养不良的琼脂。因此，殖民地生长缓慢并产生相对较少量的（蓬松）菌丝体，其收获时间从白色变成浅粉红色（图1）。关于大分子形态的细节由Leslie和Summerell（2006）给出。
4. 用4ml 0.02％（v/v）Tween-20溶液（稀释在无菌双蒸水中）洗涤SNA琼脂培养基，然后通过四层无菌乳酪布。通过使用血细胞计数器确定大分子量悬浮液的浓度，并用0.02％（v/v）吐温-20将浓度调节至5×10 4大分子/ml。
  
  图1.收获日期SNA板上的禾谷镰刀菌菌落殖民地
根浸接种[苗期]

保持幼苗免受污染。根据制造商的规格（在这种情况下与MENNO Florades），使用抗菌消毒剂进行培养和接种之前，清洁室内。

用磁力搅拌器将种子在次氯酸钠（6％）中灭菌40分钟;然后用无菌双蒸水洗10次。

在高压灭菌的沙子中播种种子，并在气候室中培养植物，16小时光周期为22℃/18℃白天/60％湿度，直到第一叶展开为止[Zadoks（Z）11; Zadoks等人，1974]。

接种前，请小心地从沙子上取下植物。

通过用铝箔包裹它们的下胚轴和茎，来孵育每个5个幼苗。这将确保只有根与真菌悬浮液接触并允许固定幼苗，如图2所示。此外，通过使用聚苯乙烯插塞中的狭缝可以将幼苗保持在适当的位置。将塞子从聚苯乙烯盘（厚度10mm）切割成平坦托盘的尺寸。对于每个室，冲孔（圆锥形凿子是有用的），足够大以允许通过幼苗根。

对于接种，通过将其根部浸入5ml的大分子悬浮液中（图2）将合并的幼苗置于平坦的托盘（分为室）中。然后在旋转振荡器上轻轻摇动2小时（图2）。对于未接种的对照植物，用0.02％（v/v）吐温-20（稀释在无菌双蒸水中）进行模拟接种。

图2.带有F的小麦幼苗的根浸接种。 gr um。。。>>>>。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。根部上的下胚轴和茎被包裹在铝箔中以避免与真菌悬浮液接触。

接种后，将单一或最多5只幼苗（不紧密包装在一起）移植到带有高压灭菌砂的单盆（7.5×7.5×8.0厘米）中。在温度为20°C，温度为22°C/18°C的气候室中培育幼苗约60％的相对湿度。显微镜检查显示，F。通过形成不同的专门的感染结构，禾谷镰刀菌积极地渗透根表皮层。为了避免破坏感染过程，在从真菌溶液中取出后立即移植幼苗。不需要进一步的治疗。种植后加入100毫升水。水应缓慢而小心地倒入水中。

在种植期间，浇水（每盆250毫升）依赖于目前的生长室（温室）条件。一般规则：砂具有有限的持水能力。因此，我们建议一旦砂面干燥[在这种情况下每4至6天]即可进行水分。请考虑议定书末尾给出的关于植物栽培和实验设置的注释2和3。

注意：在早期茎伸长期（Z32-33），根浸接种同样应用于成年植物。与根苗接种相反，使用1：2（v/v）高压灭菌砂和盆栽土壤的混合物进行根浸前后的培养，以确保正常的植物生长。根根接种后，每盆培养单株植物（11.5×11.5×12cm）;水如上所述为幼苗。支持成年植物与肥料的生长，以避免不必要的附加压力。施肥每两周进行一次，根据制造商的规格使用250毫升的Wuxal Super，或等效的肥料。
疾病严重性评估

组织采样
每个采样时间点，处理和基因型收集（例如，每个10）植物。在流水下洗涤根或浸入水中以避免根部受伤。根部应清洗，直至从根表面除去砂粒。叶鞘的薄壁组织（缠绕在幼茎上）被病原体用于定植下茎。因此，洗涤时要小心，因为患病叶鞘偶尔会变得很软，轻轻地下降

疾病对植物发育的影响
测量接种的和未接种的对照植物的根和苗长度。计算相对减少（百分比变化）为病态植物的性状表达与对照植物的性状表达之间的比例：

可见疾病症状
通过将单个褐变和症状延伸量表（0到4）应用于单一植物来评估根和茎基部的症状（图3）。褐变量范围为0，无症状; 1，坏死坏死; 2，中度坏死; 3，严重坏死; 4，完全坏死;扩展范围为：0，无病变; 1，1-24％; 2，24-49％; 3，50-75％; 4，> 75％的根或茎基变色。通过使用以下方程计算基因型 - 时间点特异性根和茎基症状指数（RSI和SbSI）：
RSI或SbSI =（E1 + E2 + ... + En/n）+（B1 + B2 + ... + Bn/n）
哪里，
B和E各自表示参数褐变和扩展刻度，
n表示每个基因型和治疗的评估个体数。茎基被称为位于子冠和第一茎节间之间的根和枝系统之间的过渡区域（图3A）。
王氏等人给出了不同程度的病根表型和坏死症状的概述。（2015）。在本出版物中，补充图S1显示了四种小麦基因型的根表型，代表抗性和中度至高度敏感反应。在敏感基因型的根和茎基础上，症状通常显示从最初的局部，轻（琥珀色）棕色变色到稍后时间点的分布较深的黑褐色病变的转变。茎基底坏死通常占最初几个人的茎基的约一半，并持续到几乎整个茎基受到或多或少的所有个体植物的影响。还请考虑议定书末尾给出的症状评估说明4。
注意：创建并排显示接种和未接种植物的顶视图照片（图3A）。例如，这样的照片可以用于通过图像分析来精确测量褐变延伸。

图3.小麦根表型和坏死症状 FRR严重程度的例子显示了高产栽培品种Tobak的幼苗。 A.用Tween-20（左）和F后接种14天后的幼苗。 graminearum （右）。接种的幼苗显示根和茎基坏死以及根系发育的降低。 B.根根接种后21天，根部和茎基症状的关闭可见。
基于参考基因的qPCR定量的DNA制备

选择和汇集每个基因型/处理/时间点的五棵幼苗的根组织，用于真菌和根生物量的定量。冷冻根液样品在液氮中，并将其储存在-80°C直到进一步使用。根据Doyle和Doyle（1990）给出的方案从根组织中提取gDNA。将所有样品的gDNA稀释为50 ng /μl作为工作溶液

在qPCR定量根生物量中制备gDNA作为植物标准品。从未接种的幼苗或幼苗收集样本。用无菌双蒸水（100,50,25,6.25,2.5625,0.39ng小麦DNA /μl）连续稀释gDNA，并将DNA保持在-20℃直到使用。

用于从F分离gDNA。 graminearum 菌丝体，用2ml 2×10 5大肠杆菌悬浮液接种100ml马铃薯葡萄糖肉汤（PDB），并在28℃的旋转振荡器上孵育3至5天（取决于对菌丝生长）。通过过滤收获菌丝体：将PDB通过四层无菌乳酪布。收集菌丝体，在液氮中研磨，并使用研钵和研杵储存在-80°C。通过应用Brandfass和Karlovsky（2008）描述的基于CTAB的方法分离gDNA。

在真菌生物量的qPCR定量中制备gDNA作为镰孢霉素标准品。用无菌双蒸水（50，10，5，1，0.5，0.1 ng禾谷物DNA /μl）连续稀释gDNA，并将DNA保持在-20°C直到使用。

注意：由于不能从单个幼苗获得足够的根部材料，特别是在根感染后的早期时间点和/或在对FRR敏感性高的情况下，使用根组织的汇集。为了确保一致性，通常应将汇总应用于所有抽样时间点（如果有的话）。在成体植物进行测试的情况下，可以采用汇集作为生物平均方法。
基于参考基因的qPCR测量根和真菌生物量

放大F。特异性片段（Nicholson等人，1998），使用引物Fg16N-F（ACAGATGACAAGATTCAGGCACA）和Fg16N-R（TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA）。为了扩增小麦DNA（泛素基因，DQ086482）使用引物Ubi-F（CCCTGGAGGTGGAGTCATCTGA）和Ubi-R（GCGGCCATCCTCAAGCTGCTTA）。

将PCR板分成两部分，每个包含小麦或真菌稀释系列，以及八个根样品三次技术重复。扩增混合物由1μl模板DNA，5μlRoche FastStart Universal SYBR Green Master，2μl双蒸水和各1μl正向和反向引物（10pmol /μl）组成。在95℃进行初始变性1.5分钟进行PCR;随后35次循环，94℃30秒，64℃45秒，72℃45秒;并在72℃下最终延伸5分钟。

分析熔解曲线，以确保只有一种产品被扩增。放大后，通过将样品加热至95℃1分钟，冷却至55℃1分钟，然后以0.5℃10秒的速度将温度从65℃缓慢升高至95℃，获得熔融曲线^-1，连续测量荧光。

按照DNA浓度的自然对数绘制每个标准稀释系列的C 值。用梯度方程式计算小麦DNA和真菌DNA的总量（ x ） >），根据下列公式（Livak和Schmittgen，2001）：

通过使用Brunner等人公布的参考基于DNA的DNA定量方法和公式计算小麦根中禾谷镰刀菌的平均含量和根样本的感染百分比（相对真菌生物量）（2009年））。

最后计算真菌和真菌的生物量，作为真菌和小麦根DNA的比例数量：

其中，DNA总数为总和。禾谷镰刀菌和小麦根DNA。
注意：计算平均感染百分比作为测定的技术和生物重复的平均值。
镰孢根腐病指数（FDI）
FDI包含所有（或选定）严重性参数：相对真菌生物量;根生物量，根长和芽长度百分比变化;根和茎基症状评分。类似于疾病进展曲线下的区域（AUDPC; Buerstmayr等人，2000），FDI可以用于在疾病条件下对基因型的整体表现进行排名（Wang等人，，2015）或遗传研究中的表型参数（Rutkoski等人，2012）。

将每个严重度参数的测量值转移到无量纲敏感指数（SI）值，以允许不同类型值之间的归一化和直接比较。使用以下公式计算SI值：
SI =（XTx）/（Y）
哪里，
X表示每个基因型和时间点（Tx）的测量值，
Y是在所有测定的基因型和时间点上计算的对应总平均值。

计算每个基因型和时间点的相应FDI值作为SI值的总和。
注意：在课程研究中，可以为每个抽样时间点计算FDI值。

数据分析

统计分析使用SPSS 20软件（IBM SPSS Statistics 20; IBM Corp.，USA）进行。重复测量方差分析（rANOVA）用于评估FRR疾病进展的时间过程。如果Mauchly对球形度的测试违反了平等假设，则适用温室 - Geisser校正来适当调整自由度。对于多次比较，应用Bonferroni调整（修正I型误差）。进行双向rANOVA测试对根系生物量，根长和枝条长度的处理和时间效应。进行混合rANOVA测试疾病进展的时间效应（变化）方面，真菌生长，疾病幼苗的根和苗生物量的减少以及根/茎基上的坏死症状发展。关于rANOVA结果的示例表格可以在Wang等人，（2015）中找到。
注意：应用软件SPSS 20提供的平均分布图（估计边际平均值）来解释显着的时间x处理相互作用。平均轮廓图的示例可以在Wang等人中找到。（2015）。受试者测试由软件SPSS 20提供的效应表给出了F值的意义的三个校正：假定的球形度，温室 - Geisser，Huynh-Feldt。

双向rANOVA用于在评估的严重程度性状（例如，相对真菌生物量）中测试显着的治疗和/或治疗x时间相互作用。根生物量和根长度减少;拍摄长度缩短]。该设计包括受试者内因素"时间"（具有x采样时间点的独立因子）和"治疗"（具有FRR接种或非接种对照的独立因子）。
注意：相对真菌生物量，根系和茎基症状指标在非接种对照植物中不可检测，因此不能在双向设计中进行检验。
混合的rANOVA用于检验严重程度性状（因变量）的显着时间效应。该设计包括受试者内因子"时间"（如双向rANOVA所述）和受试者之间因子"基因型"（测试了x个基因型）。
注意：在这里，没有包括治疗之间的比较，因此，也可以测试那些仅在接种的植物中检查的性状，而在接种或未接种的植物中可检测的性状必须作为计算的相对降低值（见步骤C2）。

笔记

疾病严重程度的变化可能是由真菌分离物侵袭性的差异引起的。琼脂培养基长时间储存可导致侵袭性降低（感染率）。因此，我们建议在感染实验前从储备溶液（储存于-80°C）制备新鲜的大分子悬浮液。
我们更喜欢在温室内的生长室中接种植物的培养。在生长室中，感染和疾病进展在独立实验之间更可靠和可比较。对于宿主 - 病原体相互作用的调查，几乎稳定的环境条件确保病原体是影响植物发育的最普遍的因素。事实上，对于成年植物的调查，生长室可能没有足够的空间
如果具有良好表征的根系感染响应的可用的标记基因型应加入实验中以确保根接种成功。例如，茎基上明显早期可见的症状发展可以快速估计感染。
坏死症状评估可能受到应考虑的某些因素的挑战。在幼苗阶段，通过对某些基因型显示的对照基因的早期天然（非致病性）褐变可以阻碍茎碱基上的坏死评价。根部坏死偶尔也不清楚，尽管真菌生长和疾病严重度测量显示对根感染的敏感性。这种现象是否来自实验问题或病原体的行为目前还没有得到答复。通常，我们观察到相当干燥的条件似乎支持病原体形成根坏死。此外，我们建议。 graminearum 能够在某些条件下发展无症状（相当内生的）生活方式（Wang等人，2015; Mudge等人，2006年））。在这种情况下，在上部茎节间扩散的疾病通常是无症状的，并且只能通过使用真菌生物量（方法E）的qPCR定量或F的诊断性PCR标记来监测。 graminearum 。在成年植物阶段，根据我们的经验，视觉症状评估是不可能的，因为植物年龄相关的根和根茎的自然褐变。

食谱

合成营养不良琼脂（SNA）
1g KH 2 PO 4
1 g KNO <3>
0.5g硫酸镁·7H 2 O 2·
0.5克KCl
0.2g葡萄糖
0.2克蔗糖
20克琼脂
溶于1L双蒸水中;然后通过在120℃高压灭菌20分钟消毒

致谢

我们要感谢Herrmann Buerstmayr教授和Marc Lemmens教授（奥地利维也纳农业生物技术系自然资源与应用生命科学大学），慷慨提供了"F"。 graminearum 接种物。这项工作得到了中国奖学金委员会的部分支持。这个协议是从研究中改编或修改的：Wang，Q.，Buxa，SV，Furch，A.，Friedt，W.and Gottwald，S。（2015）。< a class ="ke-insertfile"href = "http://xueshu.baidu.com/s?wd=paperuri%3A%28dfd138d447af44290112e4baba5f3222%29&filter=sc_long_sign&tn=SE_xueshusource_2kduw22v&sc_vurl=http%3A%2F%2Fwww.ncbi.nlm.nih.gov%2Fpubmed%2F26325125&ie=utf-8&sc_us = 17694268925617688386"target ="_ blank">对禾谷镰孢引起的幼苗根腐病的了解 28（12）：1288-1303。研究论文可以通过Qing Wang和Sven Gottwald的ResearchGate账号下载。

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