材料和试剂

SW41Ti超级离心管（Seton Scientific，目录号：7030）
永久性墨迹
10毫升注射器，带宽量规鲁尔锁套管（Vita针，量规14）
10厘米盘（Eppendorf，目录号：0030702115）
1.5ml管（RNase和DNase free）（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C或同等物）
MCF7人乳腺癌细胞系（ATCC，目录号：HTB22）
环己酰亚胺（CHX）（AMRESCO，目录号：94271）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
DEPC处理水（AMRESCO，目录号：E174）
柠檬酸饱和酚（pH 4.5）（Sigma-Aldrich，目录号：P4682）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
75％乙醇
核酸酶免费水
Oligo dT引物
dNTP mix
5x RT缓冲区
二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：R0861）}
RNase抑制剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：EO0381）
cDNA合成试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：28025013）}
10×PCR缓冲液（含15mM MgCl 2）
10μM正向引物用于感兴趣的基因/对照基因
10μM反向引物用于感兴趣的基因/对照基因
PCR试剂（New England Biolabs，目录号：M0273L）
蔗糖（RNase和DNA酶免费）（AMRESCO，目录号：0335）
氯化钾（KCl）（AMRESCO，目录号：0395）
氯化镁（MgCl 2）（AMRESCO，目录号：0288）
HEPES（pH 7.4）（Thermo Fisher Scientific，Affymetrix，目录号：16926）
IGEPAL CA-360洗涤剂（Sigma-Aldrich，目录号：I3021）
蛋白酶抑制剂鸡尾酒（AMRESCO，目录号：M250）
10％蔗糖溶液（8 ml）（见食谱）
50％蔗糖溶液（8 ml）（见配方）
Polysome裂解缓冲液（参见食谱）

设备

梯度站或任何等效梯度分馏器（Biocomp，目录号：153-002）
管夹
超离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-70或相当的）
转子SW41Ti（Beckman Coulter，目录号：331362）
200微升移液管
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：NanoDrop ^TM 2000）}
馏分收集器（Gilson，型号：FC203B）
UV监视器（Bio-Rad Laboratories，型号：EM1-Econo ^TM）
平衡
涡流

软件

Gradient Master软件（随附梯度台）

程序

渐变准备
1. 准备8毫升10％和50％的蔗糖溶液，每个在1x蔗糖梯度缓冲液中单一梯度（见配方，表1）。
2. 将溶液在真空下脱气5分钟
3. 使用渐变站提供的标记块，使用永久性墨迹标记50％管高度的超速离心管。
4. 用宽量规插管小心地加入10％蔗糖溶液至管的50％标记。
5. 将50％蔗糖溶液吸入注射器，并通过10％蔗糖溶液将插管直接插入管的底部，然后缓慢地将较重的溶液层叠到管的底部，而不会干扰10％的蔗糖溶液。较重的蔗糖溶液将缓慢推入10％溶液，50％蔗糖溶液应达到超离心管50％的标记。
6. 用橡胶盖盖住管子，将管子放在梯度台转子上的管座上
7. 在Gradient Master软件
  中运行以下预设程序程序名称：短蔗糖10-50％（w/v）快速
  程序规格：10-50％;步骤：S1/1;时间：1分45秒;角度：81.5; rpm：25（视频1）。
8. 仔细取出管，并在4°C垂直存放2 h，不受干扰。
  
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  视频1.渐变准备
  
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多核糖体分析的细胞裂解物制备
1. 在收获之前15-30分钟直接将培养基添加到培养基中，用100μg/ml的放线菌酮（CHX）将10％培养皿中的70-80％汇合细胞处理。
2. 用含有100μg/ml CHX的PBS洗涤细胞两次，并通过刮入含有100μg/ml CHX的10ml冰冷的PBS中收获。在4℃下以600×x离心5分钟，小心地弃去上清液。
3. 通过加入200μl多聚体裂解缓冲液（参见食谱）来溶解细胞沉淀。用200微升移液管轻轻混合多次，并在冰上孵育15分钟。
4. 在4℃下以10,000×g离心20分钟。
5. 将上清液转移到预先冷却的1.5ml管中
6. 使用分光光度计测量254nm处的OD。
7. 在超离心管中的梯度顶部轻轻地覆盖25-50 OD的裂解物，而不会影响梯度。在裂解层顶部的梯度管中留下2毫米的空间（图1）
8. 称量每个梯度管平衡，并通过向重叠的层添加多聚体裂解缓冲液，将含有梯度的每个管的重量调整为完全相等，而不影响梯度。
  
  图1. 10％-50％蔗糖梯度，显示梯度上方的2mm空间
超速离心和馏分收集

转杯组件和管桶在4°C预冷。

将管仔细装入桶中，不会影响梯度。将铲斗装在转子组件上，确保相对位置的重量相等。在最大真空度下，在4℃下以111,000 x g（Avg RCF）进行超速离心4小时。

在梯度轮廓仪超紫外探测器的最后一小时内，使用紫外检测器，梯度分析软件，并用运行中的DEPC处理过的水清洗分馏器多次，并通过运行空气进行干燥。

仔细取出管子，一次一桶地从桶中取出，并装入梯度分馏器的管架中，并放置在收集器活塞下方的适当位置。

通过管道运行水，并在UV监视器上按自动调零。

设置管长，梯度长度（SETON打开顶部多毛管为75厘米），设置窗口中的分数（12至16）。

运行分馏并收集1.5 ml管中的馏分（图2），并立即转移至冰上

图2.通过10-50％蔗糖密度梯度分级分析来自MCF7细胞的核糖体级分。A.在254nm测量的核糖体RNA含量相对于分数编号（上图）。 B.使用PDCD4和/或GAPDH引物（底部图），通过半定量RT-PCR分析从选定级分分离的RNA。

RNA分离和RT-PCR

向含有梯度级分的管中加入300μl苯酚（饱和柠檬酸盐，pH4.5）和300μl氯仿

漩涡30-60秒

在4℃下以16,000xg离心15分钟。

小心地将上清液转移到新管上

加入10μg糖原（不含RNA酶）和等体积的异丙醇，并将管反转多次混合。在室温下孵育30分钟

在4℃下以16,000 x g离心30分钟。

用1ml冰冷的75％乙醇洗涤RNA沉淀

空气干燥RNA沉淀，溶解于10-20μl无核酸酶的水中

在分光光度计中测量260nm处的吸光度，以确定RNA浓度。

cDNA合成：为每个RNA设定以下cDNA合成反应。

RNA
8μl

Oligo dT引物
1μl

10 mM dNTP mix
1 μl

65℃5分钟。保持冰上1分钟。
添加，

5x RT缓冲区
4μl

100 mM DTT
2μl

RNase抑制剂
0.5μl

M-MLV RT（200U /μl）
1μl

核酸酶免费水
2.5μl

在37℃孵育1小时。然后在70°C 15分钟在4°C储存。

PCR

10×PCR缓冲液（含15mM MgCl 2） 2μl

10μM正向引物用于感兴趣的基因/对照基因 1μl

10μM反向引物用于感兴趣的基因/对照基因 1μl

DNA聚合酶（1U /μl）
1μl

cDNA
2μl

核酸酶免费水
13μl

运行热循环30-35周期（95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒），并在琼脂糖凝胶上运行产物（图2）。

食谱

10％蔗糖和50％蔗糖溶液（8ml）（表1）

表1.蔗糖密度梯度制备方法

	10％蔗糖溶液（8 ml）	50％蔗糖溶液（8 ml）
蔗糖	0.8 g	4.0克
2 M KCl	400μl	400μl
1 M MgCl 2	40μl	40μl
100 mM DTT	160μl	160μl
1 M HEPES pH 7.4	160μl	160μl
100毫克/毫升环己酰胺	8μl	8μl
DEPC水	高达8 ml	高达8 ml

多聚裂解酶缓冲液
100 mM KCl
5mM MgCl 2
20 mM HEPES（pH 7.4）
0.5％NP-40
100μg/ml CHX
2 mM DTT
40 U/ml RNase抑制剂
1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒

致谢

我们感谢我们实验室的成员尝试和规范这个协议。导致这些协议发展的研究由惠康信托 - 印度联盟中级联盟（WT500139/Z/09/Z）向PSR和CSIR，印度DKP高级研究奖学金资助。该协议从Merrick和Hensold（2001）中描述的协议修改。

参考文献

Merrick，WC和Hensold，JO（2001）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471143030.cb1109s08/abstract;jsessionid=396749528FD7B4FE7711BD9BD64F7ED8.f02t03 ？userIsAuthenticated = false&deniedAccessCustomisedMessage ="target ="_ blank">纯化和半纯化系统中的真核翻译分析 Curr Protocols Cell Biolo 11-9。
Poria，DK，Guha，A.，Nandi，I. and Ray，PS（2016）。 RNA结合蛋白HuR螯合微小RNA-21以防止炎症性肿瘤抑制基因程序性细胞死亡的翻译抑制4. 致癌基因 35（13）：1703 -1715。
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