材料和试剂

移液器提示
15毫升锥形管（美国科学，目录号：1475-1611）
黑色1.5ml Eppendorf管（Argos Technologies，目录号：T7456-001）
16号针（BD，目录号：305197）
荧光素标记的AAVS1有义DNA链，具有以下序列：5'-TGGCGGCGGTTGGGGCTCGGCGCTCGCTCGCTCGCTGGGCG-3'
AAVS1 具有序列的反义链：5'-CGCCCAGCGAGCGAGCGA GCGCCGAGCCCCAACCGCCGCCA-3'
注意：可以使用任何合成设备（如IDT服务）以100纳摩尔量表合成DNA。有义链可以在5'末端用荧光素（6-FAM）标记。
纯化的重组AAV Rep68蛋白在大肠杆菌中表达，并使用Ni-NTA亲和柱纯化，随后如先前所述的凝胶过滤柱（Musayev等人，2015）
氢氧化钠（NaOH）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP358）
2-氨基-2-（羟甲基）丙烷-1,3-二醇（Tris）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Gold Bio，目录号：E-210-1）
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Gold Bio，目录号：H-401-500）
三（2-羧乙基）膦（TCEP）（Gold Bio，目录号：TECP）
双蒸水
Q1缓冲区（见配方）
Q2缓冲（见配方）
TES缓冲区（见配方）
绑定缓冲区（见配方）

设备

移液器
MonoQ阴离子交换柱（GE Healthcare，目录号：17-5166-01）
HiTrap 5 ml脱盐柱（GE Healthcare，目录号：11-0003-29）
GE Healthcare AKTA净化器
Labconco Freezone 2/5台式冻干机
Thermo Scientific NanoDrop ND-2000c分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop ^TM 2000/2000c）
Denville IncuBlock加热块
ISS PC1荧光计（ISS，型号：PC1 ^TM）

软件

Microsoft Excel
GraphPad Prism 7 ^TM
来自ISS的Vinci Instrument控制和数据采集软件

程序

荧光素标记的AAVS1 DNA的制备
1. 荧光标记的DNA可以通过HPLC纯化或使用制备型丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）直接由合成设备纯化，或者如下所述通过阴离子交换层析纯化。将DNA溶解于500μlQ1缓冲液中并注入到MonoQ阴离子交换柱中。使用从缓冲液Q1（100mM NaCl）到100％Q2缓冲液（1M NaCl）的线性梯度纯化DNA。
2. 使用预先用水预平衡的5ml GE HiTrap脱盐塔将馏分脱盐。 DNA在空隙体积中洗脱。
3. 将收集的DNA级分置于15ml锥形管中，冷冻并置于Labcono Freezone 2.5冻干机中过夜。为了允许样品干燥，15毫升锥形管的盖子应用针刺4-5次。 DNA应在第二天纤维化并干燥。
4. 冷冻干燥后，将DNA重悬于100μlTES缓冲液中。使用Thermo Scientific NanoDrop ND-2000c分光光度计测量DNA浓度，使用在260nm波长的DNA寡核苷酸的计算的消光系数。
5. 为了制备双链DNA，以相对于荧光素标记的链为1.1摩尔过量的未标记链的比例组合两个DNA链。将DNA链放入黑色的1.5 ml微量离心管中。使用Denville IncuBlock加热块，将DNA在99℃加热3分钟。然后，关闭加热块，使DNA冷却至室温
6. 使用标记的DNA链的摩尔数和混合两股之后的最终体积计算最终的DNA浓度。
用Rep68进行DNA结合研究
Rep68浓度通过使用EXPASYPrepparam位点（
http://web.expasy.org/protparam/）。在结合缓冲液中制备不同浓度的Rep68，并与DNA混合，使结合反应在20℃达到平衡20-30分钟。对于其他蛋白质，需要进行初步实验以获得要使用的浓度的粗略估计。使用结合缓冲液中最终的5nM DNA浓度进行滴定。典型的绑定实验如下执行：
1. 建议在实验前一天晚上打开PC-1荧光计以稳定仪器（图1）。在计算机上启动Vinci软件。访问仪器控制并将激发和发射滤波器分别设置为492 nm和528 nm
2. 打开PC1荧光计的灯泡，让其预热至少1小时。
3. 计算在结合反应中达到以下终浓度所需的Rep68储备溶液的量：0，10，25，50，75，100，150，200，300，400和500 nM。
  一般来说，每个浓度都会进行三次重复
4. 将不同的Rep68浓度与最终体积为300μl的5nM DNA混合。将样品孵育20-30分钟，避光。
5. 使用Vinci软件中的"单点极化"功能测量每个浓度点的各向异性值，并记录每个浓度的10次测量。
  
  图1.来自ISS的PC1荧光计

数据分析

打开Microsoft Excel中的所有数据，每个浓度计算10次测量的平均各向异性值。
使用Rep68浓度作为x值和平均各向异性作为y值制作新的Graphpad项目。
减去所有浓度的DNA各向异性值
使用Prism 7 ^TM（GraphPad），使用单个特定的绑定模型执行非线性拟合。棱镜使用以下公式：

哪里，
最大最大值是饱和度下的最大各向异性值，
C _x是Rep68的浓度，
K _d是绑定常数。
为了计算DNA结合的分数，从拟合得到的最大值用作所有DNA结合时饱和时的各向异性值（A max max）。在每个浓度下结合的DNA的分数是每个浓度（A x x x）除以Amax的各向异性。这在图2A中示出。将各浓度（A组）的各向异性值（A _x）转化为结合部分（B组）。
以下是典型实验的一个例子

图2.数据分析。 A.各向异性数据和分数结合的校正; B.数据对特定绑定模型的非线性拟合

笔记

建议在孵育步骤中，将样品远离光线，并在仪器的温度下通过水浴或加热/冷却块进行温育。
蛋白质库存在-80℃下以高浓度（〜0.1-0.5mM）储存，并在结合缓冲液中稀释至所需浓度。通常，制备100μM至100nM的一系列稀释液以覆盖滴定曲线的浓度范围。
如果不知道孵化时间，这可以通过每五分钟温育样品和阅读各向异性来确定。当测量的各向异性保持不变时，估计平衡

食谱

Q1缓冲区
10 mM NaOH
100mM NaCl（pH 12.0）
Q2缓冲区
10 mM NaOH
1M NaCl（pH 12.0）
TES缓冲区
10 mM Tris
100 mM NaCl
1mM EDTA（pH8.0）
绑定缓冲区
25 mM HEPES
200 mM NaCl
1mM TCEP（pH 7.0）

致谢

这项工作得到NIH授权R01-GM092854的支持。作者声明没有利益冲突。

参考文献

Bardelli，M.，Zarate-Perez，F.，Agundez，L.，Linden，RM，Escalante，CR and Henckaerts，E.（2016）。识别功能相关的AAV Rep68寡聚体界面。 90（15）：6612 -24。

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