材料和试剂

1.5 ml微量离心管
60毫米板
1.6毫升无RNase的微量离心管
PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（Pall，目录号：BSP0149）
哺乳动物表达质粒（Nair等人的详细信息，2016）：

pCDNA5 Helicase标志[HEV解旋酶序列使用引物PCR扩增：pCDNA5 HEL-flag FP，pCDNA5 HEL-flag RP;用Hind III消化，并连接到用Hind III和RV RV消化的pCDNA5载体中
用引物pENO ORF2-flag FP，pUNO ORF2-flag RP扩增pUNO ORF2标记[ORF2与C端标记标签进行PCR扩增;用 Bg II进行消化，并连接到用NheI（平端化和BamHⅠ）消化的pUNO载体中， br />

Huh7人肝癌细胞（获自C.M.Let; Dr. Blight等人，2000）
RNA寡核苷酸：HRNA1 5'-UUUUUUUUUUUUCGCUGAUGUCGCCUGG-3'和HRNA2 5' - [6FAM] CCAGGCGACAUCAGCG-3'（Sigma-Aldrich，USA）
无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9937）
溴化乙锭溶液（Sigma-Aldrich，目录号：E1510）
糖原（Sigma-Aldrich，目录号：G0885）
乙醇（EMD Millipore，目录号：100983）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen< sup>，目录号：11668019）
DMEM
10％胎牛血清（FBS）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Bio Basic，目录号：PD0100）
Flag M2琼脂糖树脂（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
标记肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
DEPC处理水（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9922）
Octa探针抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-807）
脱脂乳（Sigma-Aldrich，目录号：70166）
注意：本产品已停产。
抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRPO）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2004）
Clarity Western ECL印迹底物（Bio-Rad Laboratories，目录号：1705061）
银色试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：24612）
Bradford测定试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000002）
RNAsin
ATP
蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P2308）
糖原（Sigma-Aldrich，目录号：G0885）
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
乙酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A1542）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'， - 四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：03777）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：93418）
注意：本产品已停产。
焦磷酸钠四水合物（Na 4 P 2 O 4·10H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号号码：S6422）
磷酸β-甘油酯（Sigma-Aldrich，目录号：50020）
原钒酸钠（Na 3 VO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
蛋白酶抑制剂混合片（Roche Diagnostics，目录号：04693132001）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H8651）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
BSA
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
吐温20
溴苯酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
二甲苯cyanol FF（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
退火缓冲液（见配方）
浸泡缓冲液（见配方）
IP缓冲区（请参阅配方）
绞线位移缓冲器（见配方）
5x终止缓冲区（见配方）
2x蛋白酶K缓冲液（参见食谱）
含0.1％吐温20（PBST）的磷酸缓冲盐水（见配方）
50 mg/ml蛋白酶K（参见食谱）
10 mg/ml糖原（见食谱）
RNA加载染料（见配方）

设备

垂直电泳迷你装置
凝胶记录系统（Bio-Rad Laboratories，型号：ChemiDoc ^TM/MP）
NanoDrop（Thermo Fischer Scientific，USA）
热块
水浴
冷藏台式离心机
-80°C深层冷冻机
触发器摇杆
5％CO 2培养箱

程序

荧光标记的dsRNA的制备
1. 所有步骤都应使用不含核酸酶的试剂进行。
2. 在无核酸酶的水中将RNA寡核苷酸重悬于100 pmol /μl。在20％非变性PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）上溶解1μl，用溴化乙锭（2μl，10ml运行缓冲液中的10μg/ml储备液）在室温下染色15分钟，并使用凝胶记录系统显示信号UV设置。
  注意：此步骤是必要的，以排除来自源本身的寡核苷酸的偶尔降解。
3. 在40μl退火缓冲液中混合每个寡核苷酸的100pmole（100pmole /μl原液），在95℃下孵育30秒，逐渐冷却至室温。
4. 在20％非变性PAGE中解析退火的寡核苷酸并切除对应于RNA双链体的条带。
5. 将切除的条带转移到新鲜的1.5ml微量离心管中，在室温下在触发器摇杆中将500μl浸泡缓冲液浸泡过夜（16小时）。
6. 第二天，在室温下以13,000 x g离心管5分钟
7. 将上清液收集到新鲜的微量离心管中，加入5μg糖原（5mg/ml水溶液）和1ml冰冷的无水乙醇，并在-80℃下孵育45分钟。
8. 在4℃下以14,000xg离心30分钟。
9. 用500μl75％乙醇洗涤沉淀，在4℃下以14,000×g离心10分钟。
10. 去除75％乙醇，并在室温下干燥沉淀注意：卸下75％乙醇时要小心，颗粒可能会丢失。
11. 将RNA沉淀溶解在30μl不含核酸酶的水中，并在55℃下孵育10分钟。
12. 在20％非变性PAGE中运行1μldsRNA。使用适当设置（6-FAM荧光染料设定，激发：492nm，发射：518nm），使用凝胶文献系统可视化荧光RNA。
13. 使用NanoDrop通过分光光度法定量dsRNA，并以-80°C储存在无RNase的微量离心管中。
标记亲和纯化蛋白的制备
1. 按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000以1：1的比例将pugo RdRp标记和pUNO ORF2标记质粒各3μg转染到10个60mm板（每个质粒转染10个平板，不共转染）中，其中包含Huh7人肝癌细胞。在37℃，5％CO 2培养箱中孵育细胞。转染后24小时，用补充有10％胎牛血清的2ml DMEM代替培养基
2. 转染后48小时，用1×PBS洗涤细胞并重悬于800μlIP缓冲液中
3. 通过反复移液和涡旋产生均匀的悬浮液，并在4℃冰冷下孵育过夜（16小时）（冷藏室或冰箱）。
4. 第二天，通过以13,000 x g，4℃，10分钟离心澄清裂解物，并将上清液收集到新鲜的1.6毫升无RNA酶的微量离心管中。
5. 加入100μl标志琼脂糖珠，在4°C的摇臂上孵育4 h，每次1 ml IP缓冲液中洗3次，每次通过在4℃下以800 x g，1分钟离心。加入200μl标记肽（0.2mg/ml，在PBS中），并在4℃下在摇臂上孵育15分钟。在800℃离心1分钟，4℃离心，收集含有洗脱蛋白质的上清液。
6. 如下所述，使用八探针抗体和银染，通过Western印迹检查纯化蛋白的等分试样。
7. 通过10％SDS-PAGE分析蛋白质并转移到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上
8. 在室温下用1×PBS中的5％脱脂牛奶封闭膜45分钟，用4℃下的1×PBST中的5％脱脂奶稀释的1：1,000八面体探针一抗孵育过夜（16小时），洗涤3次在PBST中，在室温下用1×PBST中的5％脱脂乳稀释的1:5000抗兔IgG HRPO二级抗体进行孵育，然后使用"透明度Western ECL印迹底物"通过增强的化学发光检测信号。
9. 获取图像并使用凝胶文件系统分析。应该获得约27kDa的单一条带，如Nair等人所示。（2016）。
10. 对于银染色，在10％SDS-PAGE中分辨蛋白质
11. 按照制造商的协议（Thermo Fisher Scientific，USA），使用银色试剂盒进行银染。如Nair等人所示，应该获得大约27kDa的主要带（对应于在西方获得的频带的大小）。（2016）。在27 kDa以外也检测到另外的条带，这在我们的经验中不影响测定的效率。如果在Western和银染色中获得预期的条带，则通过Bradford测定法通过连续稀释度估计各自的蛋白质浓度，并将蛋白质在-80℃的一次使用等分试样中储存。
RNA链置换分析
1. 孵育1 pmol dsRNA和2μg标记亲和纯化的HEV解旋酶蛋白或ORF2蛋白在37℃的链置换缓冲液中2小时。可以遵循以下顺序。
  
  水
  24μl
  
  10倍缓冲区
  4μl
  
  RNAsin
  1μl
  
  ATP（10 mM）
  4μl
  
  蛋白质
  5μl
  
  dsRNA
  2μl
  
  总音量
  40μl
2. 使用适当的阴性对照，如dsRNA，不含蛋白质或dsRNA与不相关的蛋白质（ORF2）
3. 通过加入10μl5x终止缓冲液终止反应。
4. 加入50μl2x蛋白酶K缓冲液和1μl蛋白酶K（50mg/ml储备液在水中），并在37℃下孵育10分钟。
5. 向样品中加入1μl糖原（10mg/ml水溶液）和1ml冰冷的无水乙醇;在-80℃下孵育45分钟
6. 以14,000 x g，15分钟，4℃离心样品。
7. 用1 ml 75％乙醇洗涤沉淀，并重悬于10μl无核酸酶的水中注意：卸下75％乙醇时要小心，颗粒可能会丢失。虽然不一定是更好的替代方案，但是可以通过轻轻移取75％乙醇而不是直接倾析来最大限度地减少沉淀物的损失。无论采用何种处理技术，首先应注意不要打扰沉淀。
8. 加热使相同数量的含dsRNA的样品在95℃下变性10分钟
9. 将样品与10μlRNA加载染料混合，并在20％非变性PAGE中分解，以区分单链（ss）RNA和dsRNA之间的迁移。
10. 使用凝胶文件系统可视化荧光条带。

数据分析

在进行测定时，应包括适当的控制以解释数据并排除非特异性信号。阴性对照应包括从反应混合物中排除解旋酶蛋白和核苷酸。还应进行在测定中使用越来越多的解旋酶蛋白的滴定实验以排除非特异性信号。使用不相关蛋白而不是解旋酶的测定也将排除可能的非特异性信号。图1中示出了样品测定。其他因素或化合物对解旋酶活性的影响可以通过将它们加入到反应混合物中来评估。

图1.通过解旋酶测定RNA链置换。dsRNA：双链RNA，ssRNA：单链RNA，热变性：将样品在95℃下孵育10分钟，然后加载到凝胶中。

食谱

退火缓冲器
10mM Tris-Cl（pH 7.4）
100mM NaCl
1 mM EDTA
浸泡缓冲区
0.5M醋酸铵
10 mM EDTA
1％SDS
IP缓冲区
20mM Tris-Cl（pH7.4）
150 mM NaCl
1mM EDTA（pH8.0）
1mM EGTA（pH8.0）
1％Triton X-100
2.5mM焦磷酸钠
1mMβ-甘油磷酸盐
1mM原钒酸钠
1x蛋白酶抑制剂混合物（通过将一片溶解在2ml 1x PBS中制备的25x储备液）
股线位移缓冲器
50 mM HEPES（pH 7）
2mM MgCl 2
10 mM KCl
0.05 mg BSA/ml
2 mM DTT
1 mM ATP
5x终止缓冲区
1％SDS
100 mM EDTA
2x蛋白酶K缓冲液
300 mM NaCl
100mM Tris-Cl（pH7.5）
1％SDS
PBST
1x磷酸盐缓冲盐水
0.1％吐温20
50 mg/ml蛋白酶K
在无核酸酶的水中制备50 mg/ml储备溶液
10毫克/毫升糖原
在无核酸酶水中制备的10mg/ml储备溶液
RNA加载染料
0.5 mM EDTA
0.025％溴酚蓝
0.025％二甲苯cyanol FF

致谢

这项工作由Ramalingaswamy奖学金和THSTI授予MS资助。 VN得到印度政府科学技术部的资助。该协议已经从Karpe等人改编。（2010）。

参考文献

Blight，KJ，Kolykhalov，AA和Rice，CM（2000）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11110665"target ="在细胞培养中高效启动HCV RNA复制。科学 290（5498）：1972-1974。
Karpe，YA和Lole，SK（2010）。 NTPase和乙肝病毒解旋酶结构域的5'至3'RNA双链体展开活性。 84（7）：3595-602。
Nair，Anang，S.，Subramani，C.，Madhvi，A.，Bakshi，K.，Srivastava，A.，Shalimar，Nayak，B.，Ct，RK和Surjit，M。（2016）。内质网压力诱导的新型病毒因子的合成介导有效复制基因型1型戊型肝炎病毒。 PLoS Pathog 12（4）：e1005521。