材料和试剂

60毫米板
1.6毫升无RNase的微量离心管
PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（Pall，目录号：BSP0149）
尼龙膜（Pall，目录号：60207）
Whatman滤纸（Sigma-Aldrich，目录号：WHA10426972）
保鲜膜包装/塑料食品包装（一般商店/超级市场）
印刷纸（Praveen Scientific，目录号：PSC 006）
注意：它是一般印迹纸，用于常规应用中的实验室，与Whatman滤纸相似但便宜。
将哺乳动物表达质粒（pUNO RdRp-flag [具有C末端标记的RdRp序列进行PCR扩增，用"Age"，"Nhe"I消化并连接到用相同的消化的pUNO载体中]，pUNO ORF2标记[ORF2与C-末端标签标签用PCR扩增，用引物pUNO ORF2标记FP，pUNO ORF2标记RP;用BglⅡ消化，并连接到pUNO载体中消化我[blunted]和 Bam HI）; Nair等人。 [2016]）
Huh7（人肝癌细胞，获自C.M.Sm。; Blight等人，[2000]）
pSKHEV2 RdRp模板（pSK HRt）质粒（Genbank No.AF444002.1，Emerson等，2004）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen< sup>，目录号：11668019）
DMEM
10％胎牛血清（FBS）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Bio Basic，目录号：PD0100）
Flag M2琼脂糖树脂（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
标记肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
Octa探针抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-807）
脱脂奶粉（Sigma-Aldrich，目录号：70166）
注意：本产品已停产。
抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRPO）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2004）
Clarity Western ECL印迹底物（Bio-Rad Laboratories，目录号：1705061）
银色试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：24612）
Bradford测定试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000002）
我我我和第111号限制酶
Bgl II（New England Biolabs，目录号：R0144L）
PCR纯化试剂盒（Agilent Technologies，目录号：400771）
mMessage mMachine T7试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM1344）}
RNAsin
ATP
CTP
GTP
UTP
DIG-UTP
放线菌素D（Sigma-Aldrich，目录号：A1410）
DMSO
RNase A
蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P2308）
糖原（Sigma-Aldrich，目录号：G0885）
乙醇（EMD Millipore，目录号：100983）
无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9937）
琼脂糖（Bio Basic，目录号：AB0014）
DEPC处理水（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9922）
37％甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
凝胶加载染料
千年标记（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM7151）
溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E1510）
DIG Northern Starter Kit（Roche Diagnostics，目录号：12039672910）
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'， - 四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：03777）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：93418）
注意：本产品已停产。
焦磷酸钠四水合物（Na 4 P 2 O 4·10H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号号码：S6422）
磷酸β-甘油酯（Sigma-Aldrich，目录号：50020）
原钒酸钠（Na 3 VO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：04693132001）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
SDS
MOPS（Sigma-Aldrich，目录号：M5162）
乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
马来酸（Sigma-Aldrich，目录号：M0375）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
柠檬酸三钠二水合物（Himedia，目录号：RM1415）
IP（免疫沉淀）缓冲液（见配方）
5x测定缓冲液（参见食谱）
2x蛋白酶K缓冲液（参见食谱）
10x MOPS（pH 7.0）（见配方）
20x SSC缓冲液（见配方）
马来酸缓冲液（pH 7.5）（参见食谱）
1x封闭解决方案（请参阅配方）
洗涤缓冲液（pH 7.5）（参见食谱）
检测缓冲液（pH 9.5）（见配方）
含0.1％吐温20的磷酸缓冲盐水（PBST，见食谱）

设备

5％CO 2培养箱
离心机
触发器摇杆
凝胶记录系统（Bio-Rad Laboratories，型号：ChemiDoc ^TM/MP）
化学通风柜
锥形瓶
标准水平琼脂糖凝胶电泳仪
矩形玻璃托盘
玻璃板
玻璃瓶
紫外线交联剂（UVP，型号：CL-1000）

程序

标记亲和纯化蛋白质的制备
1. 按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000以1：1的比例将pugo RdRp标记和pUNO ORF2标记质粒各3μg转染到10个60mm板（每个质粒转染10个平板，不共转染）中，其中包含Huh7人肝癌细胞。在37℃，5％CO 2培养箱中孵育细胞。转染后24小时，用补充有10％胎牛血清的2ml DMEM代替培养基
2. 转染后48小时，用1x PBS洗涤细胞，并将每个皿重悬在800μlIP缓冲液中
3. 通过反复移液和涡旋产生均匀的悬浮液，并在4℃冰冷下孵育过夜（16小时）（冷藏室或冰箱）。
4. 第二天，通过以13,000 x g，4℃，10分钟离心澄清裂解物，并将上清液收集到新鲜的1.6毫升无RNA酶的微量离心管中。
5. 将所有十个平板的溶液裂解并加入100μl标志琼脂糖珠，在4℃的摇床上孵育4小时，在1ml IP缓冲液中洗涤3次，各自通过800g离心1分钟，在4℃。加入200μl标记肽（0.2mg/ml，在PBS中），并在4℃下在摇臂上孵育15分钟。在800℃离心1分钟，4℃离心，收集含有洗脱蛋白质的上清液。
6. 如下所述，使用八探针抗体和银染，通过Western印迹检查纯化蛋白的等分试样。
7. 通过10％SDS-PAGE分析蛋白质并转移到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上
8. 在室温下用1×PBS中的5％脱脂牛奶封闭膜45分钟，用4℃下的1×PBST中的5％脱脂奶稀释的1：1,000八面体探针一抗孵育过夜（16小时），洗涤3次在PBST中，在室温下用1×PBST中的5％脱脂乳稀释的1:5000抗兔IgG HRPO二级抗体进行孵育，然后使用"透明度Western ECL印迹底物"通过增强的化学发光检测信号。
9. 获取图像并使用凝胶文件系统分析。如Nair等人所示，应该获得约55kDa的单一条带。（2016）。
10. 对于银染色，在10％SDS-PAGE中分辨蛋白质
11. 按照制造商的方案（Thermo Fisher Scientific），使用银色试剂盒进行银染。如Nair等人所述，应该获得约55kDa的单一条带。（2016）。
12. 如果在Western和银染色中获得预期的条带，则通过Bradford测定法通过连续稀释度估计各自的蛋白质浓度，并将蛋白质在-80℃的一次使用等分试样中储存。
制备RdRp分析模板
1. 通过从pSKHEV2质粒中除去131-6,962个碱基，从而保护HEV基因组区域1-130个碱基和6,963-7,204个碱基（从5'端）。简言之，将pSKHEV2质粒用"Stu"I，N"I"和"T"111I限制酶消化，然后凝胶提取〜3.5kb的条带。用DNA聚合酶I klenow片段处理该片段以产生平端，随后进行自连接。得到的质粒命名为pSK HRt。可根据要求提供质粒。该质粒已在我们早期的出版物（Nair等人，2016）中有所描述。
2. 使用50μl反应混合物（5μl10x缓冲液，20μlDNA，2.5μl）将50μgpSK HRt质粒在50μl反应混合物（50μl）中，使用50U Bg II（R0144L，NEB，缓冲液3.1） μl酶和22.5μl水）。使用PCR纯化试剂盒纯化线性化DNA。根据制造商的说明，使用mMessage mMachine T7试剂盒，使用1μg线性化DNA进行体外转录，以产生340个核苷酸长封端的RNA，其用作RdRp测定中的模板以监测反义链合成。
3. 通过甲醛琼脂糖凝胶电泳验证RNA的大小和完整性
4. 通过分光光度法对RNA进行定量分析，并在-80°C下将其储存在无RNase的微量离心管中。

RdRp分析

如下所述在无RNA酶的管中装配反应。

无核酸酶水：	16μl
5x缓冲区	8μl
RNAsin	1μl
ATP（10 mM）	2μl
CTP（10 mM）	2μl
GTP（10 mM）	2μl
UTP（10 mM）	1.5μl
DIG-UTP（10 mM）	0.5μl
放线菌素D（2毫克/毫升储存在DMSO中）	1μl
蛋白质（400 ng /μl）	5μl
RNA模板（500ng /μl）	1μl
总音量	40μl

在22°C孵育2 h
使用不含蛋白质或RNA模板的RNA模板，使用不相关蛋白（ORF2）等适当的阴性对照
运行另外一个含有RdRp RNA模板的样品，并用RNase A消化（加入1μl10 mg/ml Rnase A到管中，37℃孵育10分钟）。
加入50μl2x蛋白酶K缓冲液和1μl蛋白酶K（50mg/ml储备液在水中），并在37℃下孵育10分钟。
向样品中加入1μl糖原（10mg/ml水溶液）和1ml冰冷的无水乙醇;在-80℃下孵育45分钟
以14,000 x g，15分钟，4℃离心样品。
用1 ml 75％乙醇洗涤沉淀，并重悬于10μl无核酸酶的水中。
注意：卸下75％乙醇时要小心，颗粒可能会丢失。虽然不一定是更好的替代方案，但是可以通过轻轻移取75％乙醇而不是直接倾析来最大限度地减少沉淀物的损失。无论采用何种处理技术，首先应注意不要打扰沉淀。
通过化学通风橱中的1.5％甲醛琼脂糖凝胶电泳解析样品

RNA样品的甲醛琼脂糖凝胶电泳
1. 对于100ml，在锥形瓶中加入0.75g琼脂糖在72ml DEPC处理过的水中并煮沸。当溶液冷却至55℃时，加入18ml 37％甲醛和10×10 5 MOPS。将凝胶置于凝胶运行装置中并使其固化。
  注意：不要在非常热的琼脂糖溶液中加入甲醛和MOPS。在化学通风橱中执行整个程序。
2. 运行凝胶30分钟，然后加载样品。
3. 混合5μlRNA，3μl10x MOPS，6μl甲醛，15μl甲酰胺，并在85℃下孵育10分钟，然后在冰上冷却2分钟。加入2.5μl新鲜制备的凝胶载色染料，并将样品加载到凝胶中，以1×MOPS的3-4V/cm的速度运行，直到较低的染料迁移离顶部距离的两分之一。
4. 平行运行RNA分子量标记（Millennium标记，Ambion，USA）以监测RdRp测定产物的大小。消除对应于标记物的泳道，并用溴化乙锭（2μl，10ml运行缓冲液中的10mg/ml储备液）染色15分钟以显现标记物。继续使用其余的凝胶转移到尼龙膜。
转移RNA和信号检测
1. 在20x SSC缓冲液中冲洗凝胶两次，每次15分钟
2. 在DEPC处理的水中孵育带正电的尼龙膜，直到其从下方完全湿透
3. 将膜浸入10×SSC缓冲液中5分钟
4. 在玻璃托盘中，加入20x SSC缓冲液，并将玻璃板放在玻璃罐上。将Whatman过滤纸芯涂抹在玻璃板上，使尖端完全浸入缓冲液中。
5. 将凝胶置于相反的位置。在凝胶左侧做一个缺口。
6. 将膜放在凝胶上，不会吸入气泡。
7. 用塑料包裹住凝胶的两侧并清除气泡。
8. 将与Whatman切纸相同尺寸的凝胶放在膜顶部。
9. 在Whatman论文的顶部放置一叠在同一大小凝胶上的吸墨纸。
10. 将玻璃板放在堆叠上，并在其顶部保持500g重量的支撑。
11. 允许一夜之间转移，不受干扰。
12. 第二天拆卸传送组件并将滤膜保持在滤纸上。
13. 通过紫外线交联（120毫焦耳/厘米2）将RNA固定在膜上1分钟。
14. 在DEPC处理的水中短暂冲洗膜。
15. 在室温下将洗涤缓冲液中的膜冲洗5分钟
16. 在室温下孵育20分钟的1X封闭溶液（见食谱）30分钟注意：注意不要让膜在此步骤之后的任何时候都干燥。
17. 在室温下孵育10分钟的抗DIG抗体溶液（1：10,000,1×封闭溶液）中30分钟。抗体来自DIG北方入门套件。
18. 在室温下平衡100 ml检测缓冲液5 min
19. 将膜放在开发文件夹上，并应用CDP星（DIG Northern Starter Kit的一部分），并在室温下在黑暗中孵育5分钟。
  注意：清除所有气泡。
20. 使用凝胶文件系统或使用X光胶片获取化学发光图像。

数据分析

在设置RdRp测定时，应包括适当的对照以解释数据并排除非特异性信号。必须具有阴性对照，例如从反应混合物中省去核苷酸并将RNA酶A包含在反应混合物中。在这两种情况下都不能获得乐队。还应进行使用越来越多的RdRp蛋白的滴定实验，以排除非特异性信号。使用不相关蛋白而不是RdRp进行测定也可以排除可能的非特异性信号。具有所有对照的样品测定已经在图1中示出。其他因子或化合物对RdRp活性的影响可以通过将它们加入到反应混合物中来评估。在我们的经验中，模板本身不会产生任何错误信号，因为测定依赖于DIG的检测，DIG仅作为DIG-UTP引入RNA。在琼脂糖凝胶中样品迁移期间，从反应中除去游离的DIG-UTP。此外，标记的RNA以约800个碱基对大小迁移，而模板RNA大小为380个碱基对。监测频带的大小也可以使人们对测定的输出有信心。

图1. HEV RNA依赖性RNA聚合酶活性的测定。NTPs：三磷酸核苷酸。

食谱

IP缓存（4°C存储）
20mM Tris（pH7.4）
150 mM NaCl
1mM EDTA（pH8.0）
1mM EGTA（pH8.0）
1％Triton X-100
2.5mM焦磷酸钠
1mMβ-甘油磷酸盐
1mM原钒酸钠
1x蛋白酶抑制剂混合物（通过将一片溶解在2ml 1x PBS中制备的25x储备液）
5倍试验缓冲液（-20℃保存）
200mM Tris（pH7.5）
100mM MgCl 2
200 mM DTT
200 mM KCl
100mM EDTA（pH 8.0）
2x蛋白酶K缓冲液
300 mM NaCl
100mM Tris-Cl（pH7.5）
1％SDS
10x MOPS（pH 7.0）
200 mM MOPS
50 mM NaAc
20 mM EDTA（pH 7）
20x SSC
3 M NaCl
300mM柠檬酸钠（pH7）
马来酸缓冲液（pH 7.5）
100mM马来酸
150mM NaCl（pH7.5）
1x封闭解决方案
将DIG Northern Starter Kit中的10x阻塞溶液用马来酸缓冲液稀释至1x
注意：准备新鲜。
洗涤缓冲液（pH 7.5）
100mM马来酸
150 mM NaCl
0.3％吐温20（pH 7.5）
检测缓冲液（pH 9.5）
100mM Tris-Cl
100mM NaCl（pH9.5）
含0.1％吐温20（PBST）的磷酸盐缓冲盐水 1x磷酸盐缓冲盐水
0.1％吐温20

致谢

这项工作由Ramalingaswamy奖学金和THSTI授予MS资助。 VN得到印度政府科学技术部的资助。该协议已经从Behrens等人改编。（1996）。

参考文献

Behrens，SE，Tomei，L.and De Francesco，R。（1996）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8598194" target ="_ blank">丙型肝炎病毒的RNA依赖性RNA聚合酶的鉴定和性质 EMBO J 15（1）：12-22。
Blight，KJ，Kolykhalov，AA和Rice，CM（2000）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11110665"target ="在细胞培养中高效启动HCV RNA复制。科学 290（5498）：1972-1974。
Emerson，SU，Nguyen，H.，Graff，J.，Stephany，DA，Brockington，A.and Purcell，RH（2004）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15078965"target ="_ blank"> E型肝炎病毒（HEV）基因组和表达绿色荧光蛋白的HEV复制子的体外复制。 J Virol 78（9）：4838-4846。
Nair，Anang，S.，Subramani，C.，Madhvi，A.，Bakshi，K.，Srivastava，A.，Shalimar，Nayak，B.，Ct，RK和Surjit，M。（2016）。内质网压力诱导的新型病毒因子的合成介导有效复制基因型1型戊型肝炎病毒。 PLoS Pathog 12（4）：e1005521。