材料和试剂

培养皿
移液器尖端
48孔多孔板
斑马鱼胚胎
即时海洋海盐混合（Spectrum Brands，目录号：SS15-10）
DI H 2 O
E3介质（见配方）

设备

P1000 PIPETMAN移液器
搅拌板

zBox零件清单（表1）

表1. ZBox零件清单

制造商/物品描述	零件号	数量
Newegg - 电脑
最低要求：PC，8 GB RAM，2 GHz处理器		1
PCIe Firewire 800卡	9SIA24G28M5974	1
国家仪器(DAQ)
NI PCI-6229	779068-01	1
RC68-68 Cable (1 m)	192061-01	2
CB-68LP - 非屏蔽	777145-01	2
麦克马斯特·卡尔 (结构外部)
80/20 1"x1" 框架 96"	47065T123	4
80/20 角落	47065T177	20
80/20 坚果 80x	47065T147	12
黑色PVC, 48"x48"x.	84775K942	1
236" （背）黑色PVC 36"x48"x.236	84775K742	3
侧面和顶级超级粘合钩	94985K614	10ft
循环	9489K874	10ft
乐泰黑硅胶密封剂	74945A81	1
黑色的黑色胶带	7612A94	1
直角 80/20	47065T223	2
80/20 紧固件	47065T139	2
亚克力水泥	7528A13	1
PTFE胶带	4591K11	1
通用环氧树脂	Permatex 84101	1
Nylon 6/6 Thumb Screw	96295A336	1
Thorlabs (结构内部)
面包板 24"x36"	MB2436	1
XT66 轨	XT66-500	1
XT66 燕尾	XT66DP-500	1
XT66 燕尾钳 40 mm	XT66C2	2
XT66 直角横梁	XT66CB	1
XT66 底盘	XT66P1	1
XT66 枢纽平台	XT66RC	2
Plate holder	FP01	2
10" 安装柱	P10	1
基座适配器	PB4	1
夹子叉	PF175	1
后安装夹	C1501	1
遮光布	BK5	1
直角板	AP90	1
Edmund Optics
101 x 127毫米，45度AOI，热镜	43-958	2
派克F-245 2/3"CCD相机	59-221	1
派克三脚架适配器	59-227
塑料红外滤光片	43-949	1
Na vitar
50MM F/2.8 TELECENTRIC LENS	TC-5028	1
Unibrain （1394store.com）
1米（15英尺）IEEE-1394b 9p至9p螺丝锁电缆		1
Digi-Key Electronics
100KΩ电阻器	CMF100KHFCT-ND	4
2针收件人	A99613-ND	10
2针插座	A99620-ND	20
2针头	A30770-ND	10
黄色LED	C503B-AAN-CY0B0251-ND	48
红外LED	475-2919-ND	48
白色LED	C503C-WAS-CBADA151-ND	48
蓝色LED	C503B-BAN-CY0C0461-ND	48
1欧姆电阻	P1.0W-2BK-ND	3
270欧姆电阻器	PPC270W-1CT-ND	16
390欧姆电阻器	PPC390W-1CT-ND	6
二极管	1N914B-ND	2
12 V电源	EPS377-ND	1
24 V电源	EPS357-ND	1
LED供应
BuckPuck DC LED驱动器	0302x-D-x-xxxx	1
机械车间（塑料）
定制塑料制造		1
Whatm（GE）板
所需孔数多孔板
Visaton （扬声器）	8006	2
Pyle奥迪 o （放大器）	PyleHome PCA1	1
60瓦白炽灯泡		1
简单设计家居（灯）	LD1003-WHT	1

注意：组装zBox（见图1-7）：

使用环氧树脂将两个侧壁粘合到后面板上的凹槽中（图2）。
在LED平台上的螺丝孔需要钻4-40线（图3）。
使用塑胶指旋螺丝将两个LED平台（一个用于成像红外LED，另一个用于光生代实验中的LED）安装到侧壁上的插槽（图4）。/em>
根据所需的光量，LED阵列可以连接在8 x 6或12 x 10阵列中。由于透视，最佳配置成像LED，使得阵列延伸到LED平台的侧面。因此，考虑到板的距离，IR LED可以均匀地点亮多孔板的厚度。
可以将BuckPack LED驱动器连接起来为LED阵列供电，并使用DAQ
中的TTL脉冲进行切换
多孔板平台应能够滑入侧壁上的凹槽。
将扬声器拧到多井平台的侧面（图4-6）。
使用扩散纸确保红外光均匀分布在整个井中。
将相机安装到P10帖子。 XT66导轨应构造成夹持红外线镜（图7）。

图1. zB ox 计划

图2.在 位置
中将侧壁滑入后面板凹槽和环氧树脂

图3.使用拇指螺钉将LED平台安装到侧壁插槽中

图4.将多孔板 pla tform 插入侧墙顶部

F igure 5. sp eaker 安装
的详细视图

F

图7. Cam 时代安装

软件

Matlab2014a或更高版本安装了成像处理和数据采集工具箱

程序

斑马鱼在E3培养基中以28.5℃的低密度（〜2只鱼/毫升）在培养皿中培养。
没有充气气囊的幼虫和4 dpf上没有对盘上的小水龙头的反应被删除。
幼虫通过P1000 PIPETMAN移液器在300μlE3培养基中单独移液，移液管尖端切割以防止对幼虫的损伤，并单独从培养皿转移到48孔多孔板的孔中。
为了防止实验者选择偏倚斑马鱼幼虫随机选择转移到48孔板
将48孔微板转移到保持在孤立的暗室内的有机玻璃盒（图4-7）。用恒定漫反射白光照亮的室内部由60W灯泡提供。
行为装置安置在22°C的气候控制环境中。
如果暴露于不同的处理方法，则在同一微孔板中同时测试来自不同组的幼虫
在单天实验中使用的幼虫为6 dpf，而在三天长实验中使用的幼虫为5-7 dpf。对于为期三天的实验，将测量之间的幼虫在28.5℃下在1,300μlE3保持在微孔板中过夜。该培养基在第二天更新，然后重新调整至300μl进行下一次习惯性试验。
微量板中的行为活动用CCD相机记录，CCD相机由红外LED阵列背光
行为测定包括15分钟适应高通量仪器，随后10分钟的自发活动记录，然后是习惯方案。
声音刺激由安装在与微孔板相同的平台上的两个扬声器施用。扬声器由15 W放大器供电，并提供约3毫秒持续时间的900 Hz方波。刺激通过由MATLAB控制的Native Instruments PCI-6229 DAQ传递。
习惯协议由90秒ISI（0.4 V，〜95 dB）的10次刺激，5秒ISI（0.4 V，〜95 dB）的100次刺激而成。
对于每个行为实验，从随机取样的幼虫斑马鱼分析来自多个离合器在不同日期获得的数据。我们根据经验确定，约100只幼虫的测量行为足以量化群体层面的行为变化。

数据分析

使用MATLAB脚本执行行为分析（补充材料和图8）。 README.txt文件包含有关如何运行脚本的详细信息。推荐MATLAB编程的基本技能

图8. MATLAB用户界面的屏幕截图
运行habituationProtocol.m脚本。使用声音刺激呈现之前和之后的帧之间的像素值的改变来检测逃逸。如果来自紧跟在刺激之后的两个帧的积分像素值的差异在统计学上较高（

<0.01，2-sample -test），则计数逃逸比从所有120部电影（720帧）拍摄的非逃避部分自发活动取得的像素变化值的分布。这种方法的准确性通过电影的目视检查来验证（图9）

图9.代表 im 年龄 48孔板在声音引发的逃生
为了分析行为电影，运行analyzeEscapes.m脚本。我们利用习惯指数（HI）作为衡量单个幼虫的声学惊奇习惯的度量标准。 HI被定义为在习惯条件（10秒刺激间隔[ISI]）前的最后40个高级刺激与非习惯条件下的前10个高级刺激（90秒ISI）的逃避概率的差异，，除以最后40次刺激的逸出概率（HI =最后40次/秒）。只有高度响应的鱼，在初始10次高水平刺激下90％以上的响应概率被用于计算HI（图10）。

图 ure 10。声学惊吓定量的图示例 。 A.习惯系列的前10个刺激（ISI = 90秒，n = 230）中逃脱值概率的频率分布。 B.（A）（ISI = 10秒，n = 196）中高反应性鱼的HIs频率分布。
为了确定实验组之间的差异是否显着，我们使用Mann-Whitney U-Test，它包含在脚本zBoxStat.m中。补充材料中的HIscores.mat文件提供了要分析的数据的示例。

食谱

E3胚胎培养基

制造50x库存解决方案：
15克即时海洋盐水混合物
1 L DI H 2 O
混合搅拌板〜5分钟
工作解决方案：
200毫升50x E3
10 L DI H 2 O O
2滴（约0.1ml）亚甲蓝

致谢

这项工作由国立卫生研究院生物功能光学控制纳米医学发展中心（PN2EY018241）和人类前沿科学计划（RGP0013/2010）支持。
zBox最初是由Dr. David Schoppik博士在Alex Schier博士的实验室开发的。这里描述的工作和实验方法已经从以前在Nature Neuroscience发表的研究中得到改编（Levitz >，2013）和Neuron（Pantoja ，2016）。关于zBox的用途的进一步信息在一项研究中被报道，该研究调查了神经肽在斑马鱼唤醒行为分配中的作用（Woods em> ，2014）。另外，周恩来 可以用作这种装置的使用方法的补充（Zhou 。，2014）。

参考文献

Levitz，J.，Pantoja，C.，Gaub，B.，Janovjak，H.，Reiner，A.，Hoagland，A.，Schoppik，D.，Kane，B.，Stawski，P.，Schier，AF，Trauner ，D.和Isacoff，EY（2013）。光学代谢型谷氨酸受体的控制。 16（4）：507-516。
Pantoja，C.，Hoagland，A.，Carroll，EC，Karalis，V.，Conner，A.and Isacoff，EY（2016）。斑马鱼行为个性的神经调节调节。 91（3 ）：587-601。
Woods，IG，Schoppik，D.，Shi，VJ，Zimmerman，S.，Coleman，HA，Greenwood，J.，Soucy，ER and Schier，AF（2014）。神经肽能信号分布在斑马鱼中的唤醒行为。 Neurosci 34（9）：3142-3160。
Zhou，Y.，Cattley，RT，Cario，CL，Bai，Q. and Burton，EA（2014）。使用开源MATLAB应用程序在多孔板中定量幼虫斑马鱼运动功能。 em> Protoc 9（7）：1533-1548。