材料和试剂

24孔细胞培养板（Corning，Falcon ^{®，目录号：353226）}
10厘米盘
1.5 ml微量离心管
移液器提示
26 G½针（BD，目录号：305111）
细胞刮刀（Corning，Falcon ^®，目录号：353085）
3T3-L1成纤维细胞（ATCC，克隆-173）
DMEM/10％FBS（参见食谱）

Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）粉末高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：12100046）}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：26140095）}
青霉素 - 链霉素（5,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15070063）}
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S6297）

Brefeldin A（BFA）（5μg/ml，在M-199培养基中制备）（Cell Signaling，目录号：9972）
M-199无蛋白质培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M4530）
丙酮（在-20℃冷却）（Sigma-Aldrich，目录号：320110）
Laemmli样品缓冲液（LSB）（2x，在水中稀释1倍）（Sigma-Aldrich，目录号：S3401）
三氯乙酸（TCA）（在冰上冷却）（Sigma-Aldrich，目录号：T0699）
磷酸缓冲盐水（PBS）的10倍储备溶液（参见食谱）

氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P4504）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9390）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）

磷酸缓冲盐水（PBS）的1x储备溶液（参见食谱）
聚丙烯酰胺凝胶（10％）（自制）（见配方）

30％丙烯酰胺/双溶液37.5：1（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610158）
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4509）
过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）

无脂奶粉（LabScientific，目录号：M-0842）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
山羊抗Adinsin抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-12402）
HRP共轭驴抗山羊二抗（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2020）
10倍运行缓冲器用于Western印迹的转移缓冲液（参见食谱）

甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
Tris
十二烷基硫酸钠（SDS）
乙醇（EtOH）（Decon Labs，目录号：V1016）

设备

移液器
培养箱在37℃/5％CO 2
在4℃下的微量离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus ^TM生物离心机离心机系列，目录号：75003236） >
95°C热阻
吸气器
免疫印迹设备

Mini Trans-Blot Cell和PowerPac Basic电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703989）
硝酸纤维素膜（Nitrobind，0.45μm）（VWR，目录号：490007-490）
印刷纸（VWR，目录号：28298-030）

软件

ImageJ

程序

实验准备
1. 对于每个实验条件，在DMEM/10％FBS中的24孔板（约50万个细胞/孔）的6个孔中的板3T3-L1脂肪细胞。
  注意：根据Subtil等人的方案，3T3-L1成纤维细胞在10cm皿（〜1×10 7个细胞/皿）中分化。（2000）。在DMEM/10％FBS中分化后第5天或第6天每个条件使用330万个细胞（一个10厘米的培养皿足以满足三个条件）。
2. 在24孔板中电镀后，使细胞在37℃/5％CO 2培养箱中回收过夜，然后再进行到程序B.
ER分泌测定
注意：ER分泌测定的工作流程图如图1所示。

图1.脂肪细胞ER分泌的工作流程图A.将脂肪细胞接种在24孔板的6孔中。 B.用BFA处理细胞45分钟，洗涤BFA，并使其在不含BFA的培养基中恢复各种时间。红色数字表示来自板材的孔的介质收集点和细胞溶解点。
1. 在M-199无蛋白质培养基中加入5μg/ml布雷菲德菌素A（BFA），加热至37℃。
2. 用M-199培养基洗涤所有细胞三次。在最后一次洗涤后，向每个孔中加入150μl5μg/ml BFA（M-199无蛋白质培养基）。在37℃/5％CO 2孵育细胞30分钟。在BFA治疗后，高尔基体快速塌陷，高尔基体蛋白质经逆行运送至ER。此外，BFA治疗抑制从ER到高尔基体的顺行运送，因此高尔基蛋白积累在ER中（Fujiwara等人，1988; Lippincott-Schwartz等人。，1989和1990）。因此，大多数ER后遗症重新分配回ER，大部分细胞内adipsin积累在ER中。 BFA治疗可以使细胞同步，从而准确地比较各种情况下的阿迪丝素分泌
3. 从1.5 ml Eppendorf管中的孔＃1中收集培养基。用1x PBS将孔＃1洗涤细胞一次，加入100μl1x LSB。刮去细胞并将溶解的细胞收集在1.5ml Eppendorf管中。将介质和溶解的细胞置于冰上。
4. 从孔＃2-6中取出培养基，并在37℃/5％CO 2下加入150μl预热的5μg/ml BFA（不含M-199蛋白质的培养基）15分钟>。这种额外的BFA治疗可以确保所有的ER后期药物都被清除。
5. 收集介质并溶解来自井＃2的细胞，如步骤B3所述。
6. 用M-199培养基清洗井＃3-6三次以冲洗BFA。向每个孔中加入150μlM-199培养基（无BFA），以恢复。
7. 恢复后30分钟，收集介质并溶解孔＃3中的细胞。
8. 恢复后60分钟，收集介质并溶解孔＃4中的细胞。
9. 回收120分钟后，收集介质并从＃5井溶解细胞
10. 回收后180分钟，收集介质并溶解孔＃6中的细胞。
11. 将孔＃1-6从95℃收集的溶解的细胞溶解5分钟并储存在-20℃ 注意：样品可以放在冰上，直到所有样品都已经收集，并在收集完成后一起煮沸。
TCA蛋白沉淀介质
1. 将冰冷TCA的1:10稀释液加入从孔＃1-6（即）收集的培养基中，加入15μlTCA至150μl培养基），并在冰上孵育30分钟。 br />
2. 在微量离心机中以16,000 x g旋转样品，4℃5分钟。
3. 使用移液器吸头丢弃上清液。
  注意：颗粒将在Eppendorf管的侧面看起来是一个薄而清晰的涂片，可能难以观察。当丢弃上清液时，应避免将移液管尖端靠在容纳颗粒的管的侧面，以免打扰沉淀。
4. 加入200μl冷的丙酮（预先在-20°C冷却），然后旋转
5. 在微量离心机中以16,000 x g旋转样品，4℃5分钟，以回收沉淀物。
6. 用冷丙酮再次洗涤样品（重复步骤C3-C5）。
7. 将第二丙酮洗涤的上清液和空气干燥的沉淀物在室温下除去2分钟，然后将样品置于95℃加热块中2分钟以确保丙酮被完全蒸发。如果剩余的丙酮残留，样品可以在95°C下再次放置。
8. 向每个颗粒中加入30μl的2ml Laemmli样品缓冲液，并在95℃下煮沸10分钟。将样品储存在-20°C。
蛋白质印迹
1. 在自制的10％聚丙烯酰胺凝胶上运行TCA浓缩培养基和溶解细胞的样品（参见图2A和2B）。
  注意：如果细胞裂解物是粘稠的，样品可以穿过26 G½针多次，直到粘稠。
2. 将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并在室温下将5％乳/0.1％Tween-20/PBS中的印迹阻断1小时。
3. 使用在5％牛奶/0.1％Tween-20/PBS中1:500稀释的山羊抗靛蓝抗体在4℃过夜的Adipsin探针印迹。
4. 用PBS/0.1％Tween-20在室温下洗涤3×5分钟。在室温下用1％牛奶/0.1％Tween-20/PBS稀释1：5,000的HRP共轭驴抗山羊二次抗体孵育印迹1小时。用PBS/0.1％Tween-20在室温下清洗3×5分钟
5. 使用化学发光检测系统开发印迹。

数据分析

为了测量阿维菌素分泌的速度，通过对蛋白质印迹（图2A，泳道3-6）进行光密度测定分析，定量每个条件BFA清除后每个时间点分泌的阿迪普辛量，。为了纠正不同条件下总细胞数的变化，在30分钟的BFA治疗后，再按照额外的15分钟处理（即，图2B，泳道1和2）计算出与细胞相关联的细胞数量）并取两个测量的平均值。在BFA洗脱之前，细胞相关联的Adipsin的量被用作细胞数量的量度，因为在清除之前，分泌的adipsin的量是可忽略的，并且几乎所有的adipsin都是细胞相关的。除以BFA冲洗后每个时间点分泌的Adipsin的量（图2A，泳道3-6）（图2B，泳道1和2的平均值）。
注意：

我们使用ImageJ软件进行光密度分析。
当我们探测到adipsin时，我们观察到两个波段。底部带是未修饰的形式，顶部带是阿维菌素的糖基化形式。在BFA治疗下，WT细胞中大多数的adipsin是细胞相关和未修饰的，因为adipsin被重新分配并被捕获在ER中（图2B，泳道1和2）。在BFA洗脱后，细胞相关联的Adinsin的量减少（图2B，泳道3-6），并且分泌的adipsin的量随时间线性增加（图2A，泳道3-6）。如预期的那样，大多数分泌的阿维菌素是糖基化的。当量化分析中特定点处的分泌或细胞相关的阿维肽的量时，应将两个条带的强度相加。

产生分泌的阿迪辛分泌量（校正总细胞相关adipsin）与BFA洗脱后时间的曲线，并用线性曲线拟合拟合值（图2C）。 BFA洗脱后的平均分泌率是线性曲线拟合的斜率

图2.代表数据。 A. TCA浓缩介质; B.在测定中的各个点（见图1）从板的孔中收集的溶解的细胞在聚丙烯酰胺凝胶上进行，并探测出阿迪辛。 C.作为BFA洗脱时间的函数分泌的阿迪丝素的曲线图;适合线性曲线拟合。

食谱

DMEM/10％FBS（1 L）
1包DMEM粉高葡萄糖
2.5克碳酸氢钠
10 ml青霉素 - 链霉素（5,000 U/ml）
调节pH至7.2（使用10N HCl或10N NaOH）
过滤灭菌
添加10％FBS并重新过滤消毒
10x PBS（1 L）
80克NaCl
2克KCl
21.7g Na 2 HPO 4·7H 2 O
2g KH 2 PO 4
调节pH至6.9（使用10N HCl或10N NaOH）
1x PBS
用无菌ddH 2 O稀释10倍的PBS 1:10
10％聚丙烯酰胺凝胶

解决方案（1凝胶）
4ml ddH 2 O O// 3.3ml 30％丙烯酰胺
2.5ml 1.5M Tris（pH = 8.8）
0.1 ml 10％SDS
0.1 ml 10％APS
0.004毫升TEMED
堆叠溶液（1凝胶）
2.7ml ddH 2 O
0.67ml 30％丙烯酰胺
0.5ml 1M Tris（pH = 6.8）
0.04 ml 10％SDS
0.04 ml 10％APS
0.004毫升TEMED

10倍运行缓冲器转移缓冲液（1 L）用于Western blotting 144.134克甘氨酸
30.285克Tris
注意：

对于1L 1x运行缓冲液，用H 2 O 2稀释1:10，加入10ml 10％SDS。
对于1L 1x转移缓冲液，用H 2 O 2稀释1:10，加入100ml EtOH。

致谢

这项工作得到了国家糖尿病与消化和肾脏疾病研究所（授予ROE DK52852至T.E.M.）的支持。 A. Brumfield由国家卫生研究院培训基金2T32GM008539-21支持。该协议已经从布鲁诺等人，2016年改编。

参考文献

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Fujiwara，T.，Oda，K.，Yokota，S.，Takatsuki，A.and Ikehara，Y。（1988）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 brefeldin A引起高尔基复合物的分解和内质网中分泌蛋白的积累。生物化学 263（ 34）：18545-18552。
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