材料和试剂

1-ml注射器
0.22-μm过滤器
野生型 N。本哈本植物;六至八叶期转基因N。本发明植物稳定表达oCas9（拟南芥密码子优化的Cas9） - KQ334植物
根癌土壤杆菌菌株GV3101，E。大肠杆菌DH5α，E。大肠杆菌DB3.1（用于繁殖载体pJG081）
需要以下质粒：pJG081，pKQ334（Yin等人，2015），pT-U6p-scaffold-U6t（Yin等人，2015），pCAMBIA1301， pCAMBIA2300（ www.cambia.org ），pCVA（Tang等）。，2010），pCVB（Tang等人，2010）和pMD18-T载体（Takara Bio，目录号：D101A）
注意：

为了产生用于组成型表达oCas9的构建体，将oCas9进行PCR扩增，随后通过连接独立克隆（LIC）技术（Aslanidis和de Jong，1990）克隆到pJG081中以产生pKQ334。
然后使用pKQ334转化本氏烟草以产生Cas9转基因植物-KQ334植物。 pKQ334也可用于本氏烟草中Cas9的瞬时表达。
pT-U6p-scaffold-U6t用于通过PCR诱变产生含有靶基因的gRNA的p-T-U6p-gRNA-支架。
pCVA和pCVB是基于CaLCuV的T-DNA载体。 pCVA用于产生pCVA-gRNA或pCVA-支架。 pCVB与pCVA或其衍生物组合使用以产生CaLCuV。 pMD18-T载体用于克隆PCR扩增子。
这些载体可以通过联系Dr. Yule Liu获得。

引物（表1）

表1.本协议中使用的引物
TransStart FastPfu DNA聚合酶（北京TransGen Biotech，目录号：AP221）
限制酶（New England Biolabs，储存于-20℃）

I（New England Biolabs，目录号：R0176）
Apa I（New England Biolabs，目录号：R0114）
我（新英格兰Biolabs，目录号：R0156）
I（New England Biolabs，目录号：R3140S）
Kpn I（New England Biolabs，catalog number：R3142S）
Xba I（New England Biolabs，目录号：R0145S）
Mly I（New England Biolabs，目录号：R0610）

10x Cutsmart缓冲区
抗生素
氨苄青霉素（AMRESCO，目录号：0339）
卡那霉素（AMRESCO，目录号：0408）
利福平（Sigma-Aldrich，目录号：R3501）
TIANprep Mini Plasmid Kit（TIANGEN Biotech，目录号：DP103），用于质粒DNA纯化
乙醇（北京化工厂，目录号：B0301002）
T4 DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：EP0062）}
dATP（Takara Bio，目录号：4026）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：1601383）
苯酚（Sigma-Aldrich，目录号：P4557）
3 M NaAc（Biovision，目录号：2118）
dTTP（Takara Bio，目录号：4029）
DNA纯化试剂盒（BioMED，目录号：DH103-01）
T4 DNA连接酶（Takara Bio，目录号：2011A）
Tryptone（BD，Bacto ^TM，目录号：211705）
酵母提取物（BD，Bacto ^TM，目录号：212750）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31434）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M7304）
MES（Sigma-Aldrich，目录号：M3671）
氢氧化钾（KOH）
Acetosyringone（Solarbio，目录号：A8110-1）
DMSO
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3139）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（AMRESCO，目录号：0571）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（AMRESCO，目录号：0404）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4·2H 2 O）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4·7H 2 O）
X-gluc（AMRESCO，目录号：0919）
甲醇（北京化工厂，目录号：B0301005）
铁氰化钾（AMRESCO，目录号：0713）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
PEG 8000（Sigma-Aldrich，目录号：89510）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（AMRESCO，目录号：0288）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：63068）
MES（Sigma-Aldrich，目录号：M3671）
Acetosyringone（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
EasyTaq DNA聚合酶（北京TransGen Biotech，目录号：AP111）
DNA安全植物试剂盒（TIANGEN Biotech，目录号：DP320），用于基因组DNA提取
Luria-Bertani培养基（见食谱）
MgCl 2（1M储备）（参见食谱）
MES（0.5M库存）（见配方）
Acetosyringone（1 M库存）（见配方）
渗透缓冲液（见配方）
2x磷酸盐缓冲液（pH 7）（参见食谱）
X-gluc底物溶液（参见食谱）
PEG-MgCl 2溶液（参见食谱）

设备

微量离心机（Eppendorf）
PCR循环仪（Bio-Rad Laboratories）
37℃和28℃培养箱; 37°C和28°C振动筛
NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop 1000）（用于测量DNA的浓度）
电泳仪（Junyi，北京）
真空装置（WILMAD-LABGLASS）
玻璃/塑料烧杯
高压灭菌器

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/index/html ）

程序

特定基因/感兴趣位点的gRNA设计
为了敲除感兴趣的基因，选择位于外显子中的gRNA。为了编辑基因组中的非CDS区域，请选择一个区域，其中中断将产生这种所需的效果。我们强烈建议您使用CRISPR-P（ cbi.hzau.edu.cn ）设计gRNA（Lei等人，2014）。它为每种可能的gRNA提供特异性评分，并列出潜在的脱靶。此外，它还提供了一些有用的限制性酶，其将识别用于该特异性位点的RFLP分析的gRNA间隔区。
构建gRNA质粒
为了驱动植物中的gRNA表达，我们构建了靶向铌磷酸酶的gRNA质粒。任何其他感兴趣的基因也可以被靶向。为了容易地克隆gRNA，我们首先使用了一个小载体（T-U6p-scaffold-U6t）。然后，将启动子-GRNA终止子构建体转移到较大的二进制载体，例如pCAMBIA2300和pCVA。
1. 进行反向PCR（Stemmer和Morris，1992），以在Cas9结合所需的AtU6启动子和gRNA支架之间添加gRNA间隔（图1）。设置反应如下：
  
  图1. pT-U6p-scaffold-U6t （Yin等人，2015）的示意图，以及使用反向PCR将gRNA间隔区插入pT- U6p-scaffold-U6t产生pT-U6p-gRNA-scaffold-U6t。在AtU6启动子，支架和AtU6终止子上显示橙色盒子在质粒图上。用于插入gRNA间隔区（靶向NbPDS ）的两个引物在质粒图上用它们各自的方向表示。引物上的平行黑线是互补序列。我和Pst 我用于切割gRNA表达盒，然后将其克隆到二元载体中。这里的小箭头是指示脚手架。 B.反向PCR的序列信息。这里，以gPN间隔物靶向为NbPDS 为例。 NbPDS 轨迹的部分序列显示为黑色。 PAM和Mly I网站已显示。 gRNA间隔区也显示在NbPDS基因座上方的黑色上。显示用于PCR的两个引物（oYK1056和oYK1057），来自AtU6的序列以红色显示，并且来自支架的序列显示为蓝色。在PCR过程中结合模板（载体）的两个引物也用引物和载体表示。反向PCR后的变化如箭头所示。
2. 使用以下参数进行PCR扩增（T 表示引物对的退火温度）：
3. 设置限制酶消化以除去上述PCR产物中的质粒模板，如下所示：
  注意：DpnI是甲基化敏感酶，从大肠杆菌DH5α纯化的质粒通常被甲基化。因此，DpnI通常用于去除质粒模板。在这里，连接或变性/再退火步骤不需要连接载体的末端，因为具有重叠末端的PCR产物将重新循环以形成双重切割的质粒并将在细菌中进一步修复以形成完整质粒。
  
  混匀，37℃孵育2小时。
4. 转化大肠杆菌DH5α，使用上述反应的1-2μl产物，在42℃热休克90秒，在37℃回收1小时，在LB板上用100mg/L氨苄青霉素，然后在37℃下孵育过夜（Im，2011）。
5. 选择一至五个转化体，并在含有100mg/L氨苄青霉素的LB中在37℃，220rpm下培养过夜。分别用TIANprep Mini Plasmid Kit提取质粒，并用测序引物M13-47 Sanger序列质粒pT-U6p-gRNA：NbPDS -scaffold-U6t，证实gRNA间隔物的存在。
使用fsGUS（移动GUS）记者系统检查Cas9活性和gRNA效率有必要确认KQ334植物是否保留Cas9活性，Cas9在gRNA的指导下切割DNA。在该系统中，末端具有PAM（AGG）的23bp序列被插入到GUS基因的起始密码子的下游，这导致GUS 基因的帧位移>基因（
fsGUS ）。我们共同表达了两个载体：一个携带被称为pJG081-fsGUS的35S启动子的驱动的
GUS 基因，另一个含有拟南芥U6-26基因的p2300-gRNA：fsGUS启动子（AtU6启动子） - 包含与插入到基因中的序列的前20bp匹配的20bp序列的驱动的gRNA。
基于原生质体转染检测gRNA效率的另一种高效方法。请参阅李和同事协议（Li等等，2015年）
1. 设置PCR反应以扩增其中在GUS起始密码子（图2）之后插入含有gRNA间隔区序列和MlyI识别位点的短序列的fsGUS 片段。在此步骤中使用的引物应特别设计用于侧接不同gRNA的切割位点。
  
  图2.用于检查gRNA效率的fsGUS记者系统的图示。 fsGUS记者系统的插图。含有Mly I位点的23bp序列被插入到GUS 基因的起始密码子之后，并将得到的序列指定为fsGUS 。由于插入的序列，fsGUS 不能翻译成功能酶。 fsGUS 由CaMV35S启动子驱动并置于二进制载体中。另一个二进制载体包含启动子驱动的gRNA，其靶向插入序列在fsGUS 中的前20bp。两个。将每种二元载体转化的根瘤农杆菌线混合在一起并渗透到KQ334植物叶中。两个T-DNA进入相同的细胞后，fsGUS 中插入的序列的前20bp被Cas9/gRNA复合物靶向用于切割。通过NHEJ修复将在切割位点产生内含子，并且在某些情况下恢复fsGUS 的正常编码框架，从而产生可通过GUS染色检测的功能性GUS。（这个数字是从尹等人，2015年改编和修改的），
  
  使用以下参数进行PCR扩增（T 表示引物对的退火温度）：
2. 使用PEG/MgCl 2方法纯化PCR产物（Paithankar和Prasad，1991）
3. 使用LIC方法构建pJG081-fsGUS。
  注意：LIC是一种快速，简单，非常便宜的克隆技术。它利用载体的互补突出端的退火和由9-15个碱基组成的PCR片段。
4. 摘要pJG081用于LIC反应：
5. 为此线性pJG081设置T4 DNA聚合酶处理：
  
  得到的产品被指定为pJG081-LIC。
6. 构造pJG081-fsGUS：
7. 构建p2300-gRNA：fsGUS。
8. 转基因农杆菌
9. 瞬态表达式
  注意：可以使用Cas9转基因植物（KQ334植物）或含有pKQ334质粒（Cas9的组成型表达）的另一种农杆菌培养物进行该实验。
10. GUS染色
  GUS染色测定基于Kabbage等人。（2011），执行情况如下：
构建pCVA-gRNA和pCVA支架
为了进行靶基因的VIGE，首先通过将含有AtU6启动子和gRNA :: NbPDS的盒插入pCVA来产生pCVA-gRNA。将构建体pCVA-支架作为阴性对照。
1. 设置PCR反应如下：
2. 使用以下参数进行PCR扩增（T 表示引物对的退火温度）：
3. 然后根据制造商的建议，用DNA纯化试剂盒纯化产品。
4. 设置限制酶反应如下：
5. 在37℃孵育3小时。然后用DNA纯化试剂盒纯化产物。最终产品是U6p-gRNA-scaffold_Kpn I/Xba I和U6p-scaffold_Kpn I/Xba I.
6. 同时设置限制酶反应如下：
7. 在37℃孵育3小时。然后根据制造商的建议，用DNA纯化试剂盒纯化产物。
8. 接下来，如下设置连接反应产生pCVA-gRNA和pCVA-支架
9. 在16℃下孵育8小时，并将其转化为E.大肠杆菌DH5α，然后在含有卡那霉素的培养基上选择
感兴趣的基因/位点的VIGE
1. 首先，通过热休克法将pCVA-gRNA，pCVA-支架和pCVB分别转化到根癌土壤杆菌菌株GV3101中。用卡那霉素和利福平选择中等转化体
2. 接下来，将农杆菌培养物接种到含有合适抗生素（50mg L -1，利福平，50mg L -1）的5ml Luria-Bertani培养基中， sup>卡那霉素），并在28℃振荡器中生长过夜。
3. 通过在5,000xgg离心5分钟收获土壤杆菌细胞，并重新悬浮于渗透缓冲液中，调节至600nm的光密度为1.0，并在室温下温育3至渗透前4 h
4. 将含有pCVB和pCVA或其衍生物的农杆菌培养物以1:1的比例混合，并使用1ml注射器渗透入6至8叶期KQ334植物的叶柄（Tang等人，2010 ）（图3和视频2）。作为对照，它们也使用相同的方法渗透入6至8叶期野生型植物的叶柄。
  
  图3. VIGE的图示含有pCVA-gRNA或pCVB的土壤杆菌彼此混合并渗透到KQ334植物（Cas9转基因植物）的叶柄中。系统叶用于检查基因组编辑事件。使用AtU6启动子来驱动gRNA的表达。 gRNA间隔区显示为红色。 CR，公共区域; AL1，复制相关蛋白; AL2，转录激活因子; AL3，复制增强子; AL4，推定发病相关蛋白; BL1和BR1，运动蛋白; LB，左边界; RB，右边界。（这个数字是从尹等人，2015年改编和修改的），
  
  Video 2. Agro-infiltration into petiole of N. benthamiana
检测植物基因组DNA中VIGE介导的突变
1. 为了检测VIGE结果，根据制造商的说明书从系统叶提取的基因组DNA用作使用EasyTaq DNA聚合酶在靶位点侧翼的引物（PDS_MlyIF和PDS_MlyIR）的靶向位点的PCR扩增（见下文）的模板。将纯化的产物纯化并用选择性的限制性内切酶（即，用于NbPDS的Mly I）消化，并在2％琼脂糖凝胶上运行。
2. 通过使用ImageJ比较带强度估计突变率（ https：//imagej .nih.gov/ij/index/html ）。然后从凝胶切割未切割的条带，并根据制造商的说明书使用DNA纯化试剂盒回收DNA。未消化的纯化DNA随后克隆到pMD18-T载体（TAKARA）中并转化到E中。大肠杆菌DH5α。用M13-47引物对克隆进行测序以检测突变（图3）。 NbPDS基因的VIGE的一个例子显示于图4中，其中靶向于NbPDS基因的特异性引物对的PCR产物用MlyI /我>我
  使用以下参数进行PCR扩增（T 表示引物对的退火温度）：
  
  图4. NbPDS的VIGE 。 A. VIGE靶向基因的说明NbPDS 。 Cas9/gRNA的切割位点处于红色剪刀下。 Mly 我用于区分编辑和野生型序列。 B.用于估计NbPDS基因VIGE的编辑效率的凝胶测定示意图。

数据分析

为了研究是否编辑了内源性的NbPDS基因，ImageJ用于评估VIGE的编辑效率。

选择用于分析的泳道，并添加框架以包含ImageJ的乐队（ https：//imagej.nih.gov/ij/index/html ）。
用ImageJ测量每个泳道中每个乐队的强度。
相对编辑效率通过将未切割频带的强度除以所有频带的总强度来计算

食谱

Luria-Bertani培养基
10g/L胰蛋白胨
5克/升酵母提取物
10g/L NaCl
将pH调节至7，在121℃高压灭菌20分钟，并在室温下储存
MgCl 2（1M储备）
将203.3g MgCl 2·6H 2 O溶解在800ml去离子H 2 O 2 / 用去离子水调节体积至1升
MES（0.5M库存）
将19.52 g MES溶解于200 ml去离子水中用1N KOH调节至pH 5.6
Acetosyringone（1 M库存）
将1.962 g乙酰丁香酮溶于10ml DMSO中
渗透缓冲液
注意：上面的库存缓冲液（配方2-4）用0.22μm过滤器过滤灭菌，并在室温下储存。每次新鲜地制备渗透缓冲液。
10mM MgCl 2
10 mM MES
200μM乙酰丁香酮
2x磷酸盐缓冲液（pH 7）
0.2M NaH 2 PO 4
0.2M Na 2 HPO 4

首先，做出两个解决方案：
溶液A：在1L去离子水中溶解55.2g NaH 2 PO 4·2H 2 O / 溶液B：在1L去离子水中溶解107.3g Na 2 HPO 4·7H 2 O·
在121℃高压灭菌20分钟，并将其储存在室温下
为了制备200ml 2x磷酸盐缓冲液（pH7），加入39.0ml溶液A和61.0ml溶液B，然后用去离子水稀释至200ml

X-gluc底物溶液（Kabbage等人，2011）

在0.1ml甲醇中加入1mg X-gluc
然后加入1ml 2x磷酸盐缓冲液，20μl0.1M铁氰化钾，10μl10％Triton X-100和850μl去离子水

PEG-MgCl 2 溶液

将30g PEG 8000溶于100ml 30mM MgCl 2
中
用0.22μm过滤器过滤消毒溶液，并将其储存在室温

致谢

VIGE方法是基于尹等人的报告。（2015）。接种CaLCuV的方法是基于Tang等人的。（2010）。 GUS染色测定基于Kabbage等人。（2011）。这项工作得到了中国国家基础研究计划（2014CB138400），中国全国转基因项目（2014ZX0800104B，2014ZX08010-002，2014ZX08005-001）和国家自然科学基金（31421001，3142100007）的支持。我们感谢北卡罗莱纳大学教堂山大学的爱丽丝·俞校对校对手稿。

参考文献

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