材料和试剂

100毫米培养皿（SARSTEDT，目录号：83.1802）
Kimtech科学Kim-wipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34120）
双刃不锈钢刀片（Personna，目录号：MPPB-100）
Whatman滤纸，圆形（Sigma-Aldrich，目录号：WHA10539028）
塑料移液器吸头
200μl提示（Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：02-707-452）
1 ml提示（Molecular Bio产品，目录号：3580）
磁带
12毫米圆盖玻片（Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：12-545-80）
组织培养板，24孔（Corning，Falcon ^{®，目录号：353047）}
12孔板
27 G ^1/4计量针（BD，目录号：305136）
Sprague-Dawley大鼠出生后1/3（查尔斯河实验室）
冰和冰桶
Hank的平衡盐溶液（HBSS），Ca ^{2 +}/Mg ^{2 +} free（Mediatech，目录号：21-021-CV）
70％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459844）
4％至7％的低熔点琼脂糖（45至50℃）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：16520-100）}
聚D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P7886）
超纯化层粘连蛋白，小鼠（康宁，目录号：354239）
DMEM/F12介质（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11320033）}
CFDA SE（羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：V12883）}
真空润滑脂
Ames'Medium（Sigma-Aldrich，目录号：A1420）
毒素河豚毒素（TTX）（Tocris Bioscience，目录号：1078）
萤光黄黄色CH 2钾盐（2mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：L0144）
Alexa Fluor 568酰肼（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：A10437）}
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）<>>
KCH ₃ SO 4
氯化镁（MgCl 2）
氯化钙（CaCl 2）
HEPES
葡萄糖
EGTA
MgATP
Na 2 GTP
如前所述的hiPSC-RGC特异性培养基（Teotia等人，2016）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），Ca 2+ +/sup>/Mg 2+不含（见配方）
细胞内溶液（见食谱）

设备

立体变焦显微镜（Leica Microsystems，型号：MZ6）
烘烤切片机/切碎机（Stoelting）
无菌生物安全罩（Thermo Fisher Scientific，Forma Scientific，型号：Class IIA/B3生物安全柜）
解剖罩（Thermo Fisher Scientific，Forma Scientific，卧式层流罩）
微解剖剪刀（Roboz，目录号：RS-5611）
组织镊子（牙齿较少）（哈佛仪器，目录号：72-6685）
骨骨肉（Roboz，目录号：RS-8340）
烧杯（100毫升）（康宁，PYTEX ^®，目录号：1000-100）
金属铲子
游标千分尺
水浴设置在37°C（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific）
精美的油漆刷（彩色成型机，目录号：11901）
-80°C冰箱
组织文化罩
组织培养箱设在37℃，5％CO 2（三洋）
标准荧光素异硫氰酸酯（FITC）过滤器套件
细胞刮刀
离心机（IEC，型号：Centra GP8R）
荧光显微镜（Olympus，型号：1X70）
录音室
微操纵器
使用移液管拉拔器（NARISHIGE，型号：PC）从薄壁硼硅玻璃毛细管（World Precision Instruments，目录号：TW120F-4）制造的具有〜1微米尖端的补片移液管-10或Sutter仪器，型号：P-97），电阻为5-10MΩ
贴片钳放大器（Axon Multiclamp，Molecular Devices）
高压灭菌器

软件

Axiovision 4.8软件
ImageJ（NIH）
GraphPad Prism（Graphpad，La Jolla CA）
Windows Excel（Microsoft，Redmond，USA）

程序

从PN1/3大鼠脑中分离出优良（SC）/下丘（IC）道德声明：实验方案和动物的使用由内布拉斯加大学医学中心（UNMC）的机构动物护理和使用委员会批准，并根据视力与眼科研究协会（ARVO）进行。使用声明 o f眼睛和视力研究中的动物。
1. 在出生后第1/3天的Sprague-Dawley两性大鼠被断头处死。
2. 将脑取出并转移到含有HBSS溶液的100-mm培养皿中并置于冰上（图1A-1C）。
3. SC/IC的解剖是在立体显微镜下完成的。
4. 通过小心地去除上覆的皮层，暴露出结构。尊重地可以观察到一对传播和尾部的颠簸，上下颠簸。将前后切口制成脊柱突起以收集SC。类似于尾部凸起后面的另一个切口显示IC（图1D-1E）
5. SC/IC的两侧仔细分离，保存在冰冷的HBSS中进一步处理（图1F-1G）。
  
  图1.脑解剖。蜕皮一只PN2大鼠，轻轻地从头骨中取出大脑（A-C）。移除覆盖中脑的皮层，通过水平切割去除前后轴（D-G）。
从SC/IC组织制备切片
切片机用于切片SC/IC组织。易于制备薄至100μm的部分。
1. 用70％乙醇清洗Stoelting组织切片机，用Kim-wipe完全擦拭，放入无菌解剖罩内。
2. 用Kim-wipe擦拭一个新的剃刀刀片，用70％乙醇润湿，并通过从切片机臂的左侧旋下两个螺母，将其安装在切片机右侧的刀片架上，以释放刀片架。
3. 将剃须刀的清洁面朝向游标千分尺侧面安装剃刀（图2A和2B）。
  
  图2.具有用于切片切割的双边不锈钢刀片（A，B）的加热薄纸切片机设备
4. 通过顺时针或逆时针转动游标测微计将样品台（底座垫）向左或向右移动，以确保仪器正常工作。
5. 将滤纸切成2.5×8厘米，并用HBSS润湿。
6. 将纸巾转移到滤纸的湿润区域。
7. 同时，准备新鲜制作的4％低熔点琼脂糖。
8. 称取4毫克琼脂糖在玻璃烧杯中并加入100毫升HBSS。微波烧杯3-4分钟，直到琼脂糖完全融化并开始沸腾。
9. 将融化的琼脂糖保持在50°C的水浴中，以避免凝固。间歇地摇动烧杯，使琼脂糖在整个操作过程中保持良好的混合
10. 在塑料移液器吸头的帮助下，将熔融的琼脂糖逐滴滴加到组织上，完全覆盖SC/IC组织，直到形成一堆琼脂糖。去除气泡（如果有的话）（图3）
  
  图3.琼脂糖覆盖组织的示意图
11. 将琼脂糖覆盖的组织放在冰上5-10分钟，以使琼脂糖凝固
12. 一旦琼脂糖完全固化，将滤纸放在样品台上并用胶带固定纸张（图4A）
13. 通过将样品台移动到左侧或右侧来定位其第一次切割的组织。
14. 将切片厚度设置为100μm（范围：100-300μm）。
15. 将切片机手臂向下放下，释放缓慢，让其重力下降。
16. 一旦第一次切片完成，请轻轻拿起切片机臂，将游标逆时针向前转100μm，然后再切割另一个切片（图4B）。
17. 当整个组织切片时，提起切片机臂并借助湿软刷轻轻取出表面的切屑。
18. 将切片转移到含有HBSS的培养培养皿中。
19. 使用塑料移液器吸头将切片转移到切片的末端，切割到PDL和层合蛋白涂覆的玻璃盖玻片上。
  
  图4.切片后安装在样品台（A）和组织切片上的滤纸（B）
聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白涂层和SC/IC组织切片的铺板注意：聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白分别以10μg/ml和1mg/ml的储备溶液的100μl等分试样储存在-80℃冰箱中。
将SC/IC切片到PDL和层合蛋白涂覆的无菌玻璃盖玻片转移到24孔培养板中。
1. 简言之，在SC/IC组织切片前一天，用PDL和层粘连蛋白包被盖玻片/培养板。
2. 在无菌水中制备PDL溶液（0.25 mg/ml）。添加足够的溶液以覆盖无菌玻璃盖玻片的表面。
3. 在室温下在组织培养罩中孵育过夜。
4. 第二天，抽取PDL溶液，室温下用灭菌水清洗盖玻片两次，并使其在室温下干燥。
5. 在无菌DMEM/F12培养基中制备层粘连蛋白溶液（5μg/ml）。然后，盖玻片用250-300μl层粘连蛋白/每盖玻片/孔包被。
6. 在室温下孵育2小时。
7. 吸出去除层粘连蛋白，并在室温下用DMEM/F12培养基洗两次盖玻片。
8. 如上所述，在涂覆的玻璃盖玻片上小心地将SC/IC切片放置。不要让涂层干燥。
9. 在组织切片上加入50μl介质滴，以防止干燥并促进适当的附着。在37℃/5％CO 2孵育过夜。
10. 第二天，如前所述（Teotia等人，2016），每盖玻片/孔轻轻加入300μl的hiPSC-RGC培养基。
半胱氨酸荧光素二乙酸酯，琥珀酰亚胺酯（CFDA SE）标记hiPSC-RGCs
hiPSC-RGC用CFDA细胞追踪剂标记，用于体外追踪神经突生长。 CFDA SE被动地扩散到细胞中。当琥珀酰亚胺酯基团与细胞内胺反应时，形成良好保留的荧光共轭物。染色剂的制备和细胞标记应避免光照。
1. 使用前立即用PBS稀释CFDA溶液（5μM）
2. 在12孔板中生长hiPSC-RGC，从板中除去培养基，并将CFDA溶液加入12孔培养板中的hiPSC-RGC。
3. 在37℃/5％CO 2孵育细胞15分钟。
4. 用新鲜培养基替换稀释的CFDA溶液，并在37℃/5％CO 2下孵育细胞另外30分钟。
5. 使用标准的异硫氰酸荧光素（FITC）过滤器，通过荧光显微镜观察CFDA标记的细胞。细胞现在可以用于共培养实验。染色后可以将CFDA标记的细胞培养1-2周
在程序C中所述的同一板中建立hiPSC-RGC的共培养
1. 从37℃/5％CO 2培养箱中取出方法C所述的含有SC/IC组织切片的PDL和层粘连蛋白包被的板，吸出培养基并保持在组织培养罩中。
2. 同时，使用细胞刮刀从12孔板分离hiPSC-RGC
3. 以220×g离心细胞5分钟以获得细胞沉淀并抽出上清液。
4. 将细胞悬浮于1ml新鲜培养基中，轻轻混合并加入50μl含有HiPSC-RGCs（〜3-6 /盖玻片）的培养基，远离上述PDL和层粘连蛋白包被的盖玻片上的SC/IC切片。
5. 将板返回培养箱，并在37℃/5％CO 2下孵育过夜。允许细胞粘附，第二天，加入300μlhiPSC-RGCs培养基。
6. 每2-4天更换培养基。 hiPSC-RGC可以与SC/IC切片在体外共培养8天。
7. 一旦神经突生长达到相当长的长度，将盖玻片安装在玻璃片和荧光显微镜下的图像上（图5）。
  
  图5.与IC细胞聚集（B）共培养的CFDA标签的hiPSC-RGC，详细阐述了SC细胞聚集的长期过程（A）。比例尺= 50μm
8. 比较延伸到SC和IC切片的hiPSC-RGCs的神经突生长的长度和复杂性。 hiPSC-RGC可以通过细胞胞浆的CFDA染色来区分SC/IC切片的清晰边界。
与SC组织切片共同培养的hiPSC-RGCs的电生理学全细胞膜片钳电生理学允许记录与SC组织切片共同培养的hiPSC-RGCs的膜电压变化，例如动作电位和兴奋性和抑制性突触电位以及引起这些电压变化的离子电流。前者使用电流钳位记录模式完成，而后者在电压钳记录中完成（Molleman，2003; Marty和Neher，2009; Teotia等人，2016）。
1. 在几个真空润滑脂点上，在记录室上装载含有SC切片共同培养的hiPSC-RGCs的盖玻片。
2. 将记录室放置在配备电生理学硬件和超级清洁剂的直立式固定级显微镜的台面上，以约1-4ml/min的速度，用Ames's Medium鼓泡5％CO 2气体混合物和95％O 2。
3. 为了建立全细胞记录，通过移液管提供温和的正压，并使用显微操纵器将其置于靶细胞的膜上，同时在显微镜下观察细胞和移液管。
4. 使用膜片钳放大器提供5 mV去极化步骤来测量电阻。移液管接触细胞膜时，阻力会稍微上升。
5. 释放正压力并提供温和的吸力，同时监测阻力以形成GΩ密封（密封电阻> 1GΩ）。
6. 一旦形成GΩ密封，施加保持电位（-70 mV），并使用强力吸力脉冲，使用注射器逐渐温和抽吸或放大器的"zap"功能来破坏贴片。全细胞电容瞬变的出现表明贴片的成功破裂和全细胞记录的建立。
7. 在电压钳中，要记录电压门控钠和钾电流（INa和IK），设计一个协议，其中放大器以10 mV（高达+50 mV）的增量去极化电池。使用P/8泄漏减法协议从数据中减去膜泄漏和全细胞电容瞬变
8. INa将是快速内向电流，其快速灭活，而IK通常是缓慢发展和非钝化的向外电流（图6）。
9. 通过使用5 mV去极化脉冲注意访问电阻（Ra）来监控全单元记录的质量。 Ra应尽可能低（，即，<40MΩ），并且在整个记录期间应保持相对稳定。大的Ra会引起相当大的电压误差，扭曲当前电压依赖性和振幅的测量。
10. 如果INa足够大，电池可能会产生动作电位，以响应电流钳模式下的去极化电流注入（+ 10至+300 pA）（图1）。 INa通常被河豚毒素河豚毒素阻断，其可以加入到细胞外溶液中，并以0.5-2μM的浓度超过细胞。
  
  图6.与SC切片共培养的hiPSC-RGCs的实施例记录。A.全细胞电压钳记录I和N >响应于步进去极化（150msec，从保持电位为-76mV至-66mV至+ 24mV）。 I 被1mM TTX阻断。 B.在对照条件下和存在1mM TTX时，将去极化步骤的电流响应的扩展时间轴扩展至-26mV。 C.电流钳记录显示对超极化和去极化电流注入的电压响应（-20至+50pA）。该细胞响应于去极化电流注射而触发动作电位。

数据分析

树突状分枝的成像，定量和分析

使用荧光显微镜从3-6个独立的共同培养实验将玻片上的盖玻片放在玻片上并捕获图像。
对于神经突追踪和sholl分析，使用Axiovision 4.8软件在Zeiss立式荧光显微镜上以20倍物镜收集图像。使用ImageJ（NIH）进行图像分析。使用ImageJ中的插件Sholl Analysis（v1.50），如前所述，从神经花环的边缘放置20微米的同心圆（Teotia等人），独立地测量树突状枝的长度和复杂性。，2016）。
使用GraphPad Prism（Graphpad，La Jolla CA）和Windows Excel（Microsoft，Redmond，USA）分析和绘制数据。通过配对的Student's 测试（双尾）或通过单因素方差分析（ANOVA）计算统计学显着性。

笔记

当成像细胞时，重要的是避免CFDA标记细胞在SC/IC组织上重叠的区域，并尝试仅考虑细胞与SC/IC外植体并置的区域。
CFDA标记后的细胞可立即使用。 CFDA的无毒和长期保留使荧光在染色后数天保持良好。但是，如果细胞毒性每天都会改变培养基。
当报告电压时，重要的是考虑到在移液管溶液和细胞外溶液的界面处产生的液体接合电位。尽管各种软件程序可以计算出这个值，但理想情况下，对于所使用的解决方案的每种组合都应以经验为基础。将我们的细胞内溶液和Ames培养基的LJP测量为6mV。
细胞内也可以含有萤光黄黄色二钾盐（2mg/ml），以观察细胞形态。萤光黄黄色CH是具有峰值约430nm的激发光谱的固定染料，并且发射峰值在540nm附近，如果需要，可以在全细胞记录后与免疫细胞化学结合显现。对于不同的波长范围，其他染料如Alexa Fluor 568 Hydrazide可以以100-200μM使用。
TTX解决方案应小心处理，并根据制度准则妥善处理。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
4.3mM Na 2 HPO 4
1.47mM KH 2 PO 4
调整到7.4的最终pH值在121℃高压灭菌30分钟
细胞内溶液
98mM KCH 3< 3< 4>< 4>
44 mM KCl
3 mM NaCl
3mM MgCl 2
1mM CaCl 2
5 mM HEPES
2 mM葡萄糖
3 mM EGTA
1 mM MgATP
1mM Na 2 GTP
调整pH至7.3
精神压力调整至〜280 mOsm

致谢

这项工作得到NIH/NEI R01-EY022051（IA）的支持。

参考文献

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