材料和试剂

防护手套和实验室外套
弗林特玻璃培养管16 x 150毫米（VWR，目录号：60825-435）
50ml锥形管（Corning，Falcon ^®，目录号：352098）
Fisherbrand 100 x 20毫米培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875711Z）
10ml注射器（BD，目录号：301604）
25 G 5/8针（BD，目录号：305122）
70微米的细胞过滤器（Corning，Falcon ^{®，目录号：352350）}
1.7ml微量离心管
普通显微镜幻灯片（VWR，目录号：48300-025）
Kim-Kap ^TM一次性闭合; 16毫米（Kimble Chase生命科学研究产品，目录号：7366316）
Miltenyi列（Miltenyi Biotec，目录号：130-021-101）
WT-FarRed670菌株。白色念珠菌（Hopke等人，2016）
WT-GFP株（Wheeler等人，2008）
C57BL/6J小鼠，6-10周龄（JACKSON LABORATORIES，目录号：000664）
甘油（EMD Millipore，目录号：GX0185-5）
抗Ly6G生物素抗体（Thermo Fisher Scientific，eBioscience，目录号：13-5931-85）
抗生物素磁珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-090-485）
台盼蓝（Lonza，目录号：17-942E）
FluoReporter ^®细胞表面生物素化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：F20650）}
Alexa Fluor 647缀合的链霉亲和素（Jackson ImmunoResearch，目录号：016-600-084）
抗髓过氧化物酶（MPO）（R& D Systems，目录号：AF3667）
抗组蛋白H3（瓜氨酸R2 + R8 + R17）（Abcam，目录号：ab5103）
Sytox Green（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：S7020）
Calcofluor白/荧光增白剂28（Sigma-Aldrich，目录号：F3543）
驴抗山羊IgG Cy3（Jackson ImmunoResearch，目录号：705-165-147）
驴抗兔IgG Cy3（Jackson ImmunoResearch，目录号：711-165-152）
sDectin-1-Fc（根据[Graham等人，2006]）在家制造）
驴抗人IgG Cy3（Jackson ImmunoResearch，目录号：709-165-149）
指甲油
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-3）
无水磷酸氢钠（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：S374-500）
磷酸氢钾，一水合无水（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P285-500）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S7795）
BD Bacto蛋白胨（BD，Bacto ^{TM，目录号：211677）}
BD Bacto酵母提取物（BD，Bacto ^{TM，目录号：212750）}
葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D-163）
BD Bacto琼脂（BD，Bacto ^{TM，目录号：214014）}
加热灭活的胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10082147）}
Probumin ^®牛血清白蛋白诊断级粉末（EMD Millipore，目录号：820451）
RPMI，25 mM HEPES和L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：12-115F）
氯化铵（NH 4 Cl）（EMD Millipore，目录号：AX12701）
结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C0775）
乙酸（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
Tris碱（AMRESCO，目录号：0497）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A144-500）
PBS，pH 7.2（参见食谱）
PBS + Na 2 CO 3，pH 8（参见食谱）
YPD肉汤（见食谱）
PBS + 5％FBS（见食谱）
PBS + 2％FBS（参见食谱）
PBS + 2％BSA（参见食谱）
RPMI + 5％FBS（见配方）
Tris-HCl，pH 8.0（参见食谱）
TAC缓冲（见配方）
土耳其人解决方案（见配方）

设备

滚筒（Eppendorf，新不伦瑞克科学）和孵化器（VWR）
血细胞计数器用于细胞计数（Hausser Scientific，目录号：1492）
分光光度计（Eppendorf; Biophotometer）
用适用于15和50毫升锥形管的离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM Legend ^TM RT）
AutoMACs分离系统（Miltenyi Biotec，型号：autoMACS ^{®//Pro Pro Separator）}
蔡司Axiovision荧光显微镜（Zeiss;定制）
解剖套件（VWR，目录号：631-0616）
pH计（Fisher Scientific，型号：accumet ^TM Excel XL15）
用于1.7ml管的微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
高压灭菌器
500毫升瓶（VWR，目录号：89000-233）
水浴

软件

AxioVision Rel48软件（Zeiss： https：//www.zeiss.com/microscopy/us/downloads/axiovision-downloads.html ）
Photoshop（Adobe Systems，San Jose，CA）

程序

白念珠菌菌丝生长（3天;参见图2A的步骤示意图）

图2.协议前三个步骤的原理图

条纹适当的菌株C。白色念珠菌与来自冷冻的25％甘油原液的单个菌落在YPD琼脂上（参见食谱）并在37℃下孵育过夜。对于这些实验，我们使用WT-FarRed670菌株。白色念珠菌（基因型：P ENO1 :: P _ENO1 -FarRed670-NAT ^R; [Hopke等人，2016]）。
第二天挑一个殖民地并转移到5ml的YPD液体中（见食谱）。我们将5毫升的16毫升150毫米火石玻璃管放上盖子，并在30℃下在滚筒上孵育过夜。收获YPD培养物并使用血细胞计数器计数酵母。
以2.5×10 6细胞/ml的浓度稀释到30ml RPMI中，并分成5ml等分试样。在滚筒上在30℃下孵育过夜。将RPMI培养液倒入50ml锥形管中，以3,000×g离心5分钟。去除大部分上清液（因此只剩下约5毫升的残留物），然后轻轻地将沉淀物重新悬浮在剩余的液体中。由于菌丝的形态，您不能使用血细胞计数器来确定细胞数量，而是使用分光光度计来估计菌丝的浓度。 600的OD 600相当于1×10 7个细胞/ml。虽然通过OD 600定量菌丝不如量化酵母那样准确，但是我们发现它提供了可重复的结果。调整至3×10 8细胞/ml以用作测定中的储备溶液。
注意：您将在小体积内具有高度集中的菌丝数量，因此最好在找到OD <600> 之前进行稀释，以确保您落在可读范围内并保存细胞。我们的比色皿通常需要1毫升，所以我们取100微升菌丝并加入到900微升PBS中。 PBS将作为您的空白对照。

分离小鼠骨髓（1-2小时;参见图2B的程序原理图;详细视频方案参见[Swamydas和Lionakis，2013]）
1. 通过CO 2吸入安慰两个6-10周龄的两只C57BL/6J雌性小鼠，然后颈椎脱位。解剖后腿获取股骨和胫骨。取出所有的肉，并用PBS + 5％FBS转移到培养皿中（见食谱）。
2. 用PBS + 5％FBS填充10ml注射器，并附上25 G 5/8针。将针插入骨头并排出注射器中的液体以将骨髓推出培养皿（如果难以插入针头，则可以夹住骨骼的两端）。
3. 当所有骨髓已经释放到培养皿中时，将其通过70μm的细胞过滤器并转移到50ml圆锥形中。以300×g离心3分钟。
注意：

最好用没有软组织残留的培养皿驱除骨髓。组织会堵塞针头。如果需要，您可以在一个培养皿中完成骨骼清洁，然后将骨骼移至另一个PBS + 5％FBS，然后驱除骨髓。
所有动物研究均按照"国家卫生研究院实验动物护理和使用指南"中的建议进行。动物通过吸入二氧化碳来安乐死。感染动物每天监测两次感染迹象，并对病态动物进行安乐死。 UMaine IACUC /伦理委员会批准了该协议

通过AutoMACs从小鼠骨髓中分离嗜中性粒细胞（1.5-2小时;参见图2C的程序示意图）
1. 弃去上清液，并用圆锥形管重新悬浮沉淀。加入3ml Tris /氯化铵（TAC）缓冲液（见Recipes），并在室温下孵育1分钟以溶解任何红细胞。孵育后，用PBS + 2％FBS稀释至30ml。取10μl骨髓溶液，加入40μl土耳其人溶液（参见食谱）。在血细胞计数器上计数细胞。
2. 将骨髓溶液以300 x g离心3分钟。丢弃上清液并轻轻将沉淀重悬于PBS + 2％FBS中，浓度为1×10 8个细胞/ml。与抗-IL6G生物素抗体（0.5mg/ml的储备）一起在1μl抗体/100μl骨髓中在冰上孵育15分钟。通过在300×g离心3分钟并且弃去上清液洗涤。重悬于10ml PBS + 5％FBS中，然后再次离心。弃去上清液，再次悬浮于10ml PBS + 5％FBS中。与抗生物素磁珠（10μl/1×10 7个细胞）一起在冰上孵育30分钟。在整个孵化期间定期搅动。如上所述用10ml PBS + 5％FBS洗涤一次。将沉淀重悬于1ml PBS + 5％FBS中注意：在此期间，打开AutoMACS并运行CLEAN循环。
3. 一旦完成，将正面和负面的口中清洁出50ml锥形管。将骨髓放在进气口并运行正选择程序。当除了0.2毫升体积以外的所有摄入量中，加入1毫升PBS + 2％FBS。这确保了所有的残留样品都被加载到色谱柱上，而不会显着增加体积。收集正负分数*。以300×g离心阳性部分3分钟。弃去上清液并重悬于2ml RPMI + 5％FBS中。在血细胞计数器上计数嗜中性粒细胞前，取10μl加入90μl台盼蓝。
4. *负数部分被保存，因为如果机器出现问题并且嗜中性粒细胞不分离，则可以重新运行。一旦您确认阳性部分中存在嗜中性粒细胞，就可以将其丢弃。或者，阴性部分可用于产生骨髓来源的巨噬细胞。
注意：

土耳其人溶液用于对收集的骨髓中的细胞进行计数，因为它有效地裂解不经TAC治疗裂解的红细胞。裂解红细胞是重要的，因为它可以更容易地计数白细胞。
来自两只BL/6J小鼠的胫骨和股骨的预期产量约为1×10 8个细胞。来自两只BL/6J小鼠的嗜中性粒细胞的预期产量通常至少为1.4×10 7个细胞。
在计数血细胞计数器时，通过光学显微镜监测嗜中性粒细胞纯化。额外的确认可来自用抗Ly6G抗体标记并用流式细胞仪分析（参见[Swamydas和Lionakis，2013]）。
该过程的细节将根据特定的磁性细胞分选器而变化。这些细节适用于AutoMACS（Miltenyi），尽管可以使用Miltenyi列手动进行纯化。
可以从制造商处获得一个解释如何使用AutoMACS的视频。请参阅以下网址： https：//www.youtube.com/watch?v=h06klEgji4o 。

生物素化和荧光链霉亲和素标记。白色念珠菌细胞壁。
注意：为了检查嗜中性粒细胞与细胞壁的相互作用，可以使用荧光标记。该标记可以与从骨髓分离的嗜中性粒细胞平行进行。虽然我们通常不会在参与NETs的实验中使用这一步骤，但是在其他测定中广泛使用这一步骤，可以看到嗜中性粒细胞介导的真菌细胞壁的变化。白色念珠菌细胞壁的基本图示于图1A中。白色念珠菌细胞壁的详细原理图在文献中广泛可用（参见[Perez-Garcia et al。，2011]）：
1. 该方案使用FluoReporter ^®细胞表面生物素化试剂盒。在该试剂盒中，胺反应性生物素与细胞壁蛋白共价键合。使用一个新的试剂盒，取一个生物素小瓶，并将其重新悬浮于250μlDMSO中以制备0.2mg/ml生物素-XX SSE的储备溶液。这可以保存在-20°C，并在以后的实验中重新使用，直到不见了。
2. 与您的 C。白细胞在3×10 8细胞/ml，取足够的体积，以便您将要运行的每个样品具有3×10 ⁷细胞。为了保持这个浓度，在微量离心机中用相同体积的液体进行所有的洗涤步骤，并以15,000 x g的速度旋转30秒。
3. 在pH8下用PBS + Na 2 CO 3洗涤一次（参见食谱）。
4. 将菌丝重悬于PBS + Na 2 CO 3（pH 8）中，并在室温下以0.01μg/μl的生物素-XO SSE染色15分钟。 >
5. 用PBS pH 7.2洗三次。重悬于PBS pH 7.2。
6. 用36μg/ml荧光标记的链霉亲和素在室温下染色30分钟。
7. 用PBS pH 7.2洗涤一次，并重悬于PBS pH 7.2中直至准备好与嗜中性粒细胞一起使用。
注意：使用的荧光标记将取决于实验。在细胞壁破坏实验期间，我们通常使用Alexa Fluor 647缀合的链霉抗生物素蛋白，以便绿色和红色荧光通道可用于其他标签。
呼吸/免疫细胞相互作用（2.5小时）
在具有RPMI + 5％FBS的1.7ml微量离心管中，将总共1.7ml的3×10 7细胞细胞与有或没有7×10 6个嗜中性粒细胞孵育，总共1.7ml旋转器在37℃下搅拌2.5小时。不含嗜中性粒细胞的样品作为对照注意：重要的是让微量离心管几乎完全充满介质，以使嗜中性粒细胞和菌丝不会被困在气管两侧的管中并被干燥。
NET可视化染色（3 h;染色过程示意图见图3A）

图3.协议染色步骤示意图
1. 注意，除非另有说明，否则所有步骤均在冰上和冰冷的缓冲液中进行。这可以防止这些活细胞中的任何其他代谢功能。
2. 将微量离心机中的样品以最大速度（15,000-21,000 x g ）旋转30秒。取出上清液，用500μlPBS洗一次。
3. 重悬于200μlPBS + 2％BSA中以封闭样品。在室温下孵育30分钟。
4. 在这一点上，将所有样本分成两半，一个将接收一次抗体，另一个将不作为对照。
5. 在微量离心管中旋转样品，弃去上清液。
6. 将样品重悬于含有一抗或100％PBS + 2％BSA（无主要对照）的100μlPBS + 2％BSA中。第一抗体可以是抗髓过氧化物酶（0.1mg/ml）或抗组蛋白H3瓜氨酸R2 + R8 + R17（0.014mg/ml）。
7. 将样品在冰上孵育1小时。
8. 用500μlPBS洗涤样品3-5次。
9. 在最终洗涤后，将总共100μlPBS + 2％BSA的Sytox Green（156nM），calcofluor white（25ng/ml）和第二抗体重新悬浮所有样品（无论是初级对照组和无主要对照组）。对于用抗MPO初级染色的样品，我们使用的二抗是驴抗山羊IgG Cy3（0.007mg/ml），对于用抗组蛋白染色的样品，我们使用的是驴抗兔IgG Cy3（0.0075 mg/ml）。
  注意：Sytox Green是一种非膜可渗透的DNA染色剂，在结合NETs中发现的细胞外DNA后会发出明亮的荧光。 CFW是真菌细胞壁中几丁质的污渍。
10. 在室温下孵育30分钟。
11. 孵育后，用PBS洗涤样品3-5次，并重悬于35μlPBS中。
可视化嗜中性粒细胞介导的真菌细胞壁的破坏（染色过程的示意图参见图3B）

作为NET组分染色的替代方案，方案的轻微改变将允许中性粒细胞介导的真菌细胞壁变化的可视化。这涉及用sDectin-1-Fc染色以寻找炎症真菌病原体相关分子模式β-葡聚糖的暴露，用calcofluor白色染色以寻找真菌甲壳素的变化和外部细胞壁的荧光标记，如步骤4检查这种外层的免疫介导的破坏。如上所述遵循步骤1-5，但跳过步骤6。
将微量离心机中的样品以最大速度旋转30秒。取出上清液，用500μlPBS洗一次
重悬于200μlPBS + 2％BSA中以封闭样品。在室温下孵育30分钟。
将样品重悬在总共50μlPBS + 2％BSA中，以17μg/ml的sDectin-1-Fc。在冰上孵育1小时。
用500μlPBS洗涤样品3-5次。
最终洗涤后，将总共200μlPBS + 2％BSA与calcofluor白色（CFW; 25ng/ml）和驴抗人IgG Cy3二抗（0.8mg/ml）重新悬浮所有样品。在室温下孵育30分钟。孵育后，用PBS洗涤样品3-5次，并重悬于35μlPBS中。
注意：为了减少每个样品使用的sDectin-1-Fc的量，sDectin-1-Fc染色步骤通常以比完成的阻断或二级抗体步骤更小的体积（50μl）进行用200μl。
样品现在可以通过荧光显微镜观察。使用干净的玻璃片，加载5μl样品，并在上面放置盖玻片。盖玻片可以用指甲油密封，以防止成像期间发生干燥。根据实验问题，选择随机视场或特定位点进行成像。
一旦设置，所有图像的所有通道的曝光时间保持不变。从所有样品中获得相等数量的图像用于分析。
菌丝将其细胞壁中的几丁质染色为CFW。由sDectin-1-Fc结合的暴露的β-葡聚糖的区域将被Cy3荧光信号（通过图1B中的图示和通过图4中的显微镜显示）标记。可以通过检查荧光抗生蛋白链菌素信号的损失来检测外细胞壁的嗜中性粒细胞攻击区域（图4A）。通常使用"C"可以包括生存力指标。白念珠菌菌株与细胞质荧光团表达。对于这些实验，可以使用营养型WT-GFP（Genotype：SC5314 Peno1 :: Peno1-EGFP -NAT），[Wheeler等人]。，2008]）。

数据分析

对于NET染色，分析集中在定性评估MPO和瓜氨酸H3信号是否存在于染色样品中，与细胞外DNA共定位，并没有出现在无主要对照（图5）中。
对于细胞壁损伤的分析，有许多选项可用，并且取决于被测试的假设。对于具有z-stack的图像，我们首先使用标准的Zeiss Axiovision软件（Zeiss Microscopy）创建最大图像投影。我们分析了这些数据的一种方法是检查显示特定细胞壁变化的所有图像中活细胞的百分比（图4D）。当尝试确定特异性抑制剂或真菌或嗜中性粒细胞一侧的遗传敲除是否会破坏该过程时，这种分析是有用的。我们还通过确定感兴趣的特定位点的染色的平均荧光强度（MFI）并将其与对照中看到的MFI（图4C）进行比较，分析了该数据。 MFI可以通过许多程序获得。我们用Zeiss Axiovision显微镜捕获了我们的图像，并用Axiovision软件确定了MFI。该分析已被证明可用于定量测量特异性细胞壁变化的重叠（例如：在嗜中性粒细胞攻击部位增加的CFW染色区域增加的sDectin-1-Fc染色重叠）。当使用具有荧光蛋白融合的真菌菌株时，也证明可用于证明特定部位细胞壁组分水平的变化。

注意：

为了进行这些比较，在实验（实验样品和对照）中进行比较的所有图像必须以相同的曝光时间获得。还应获得并分析所有样品的相等数量的图像。我们通常每个实验使用12到20个视野。这些视野可以随机获得，也可以通过根据实验找到特定的部位;请注意，应使用中性通道（如明场）选择场，以消除潜在的偏差。通常，进行三次独立实验，数据显示为三次实验的平均值±标准误差。请注意，这里仅显示一个字段的量化，因此没有错误栏。
在分析图像时，我们避免在分析中包含菌丝的提示。这些提示可能是最初未生物素化的新生长的部位，这种增长可能导致与嗜中性粒细胞的相互作用无关的细胞壁变化，这将使分析复杂化。这些区域的示例在图4E-4F中示出。我们也避免了互相重叠的菌丝，特别是在检查MFI时，确保每个菌丝段得到很好的解决。

图4.在中性粒细胞发作后菌丝细胞壁的体外染色针对攻击部位显示sDectin-1-Fc染色测定的代表性结果，对于无嗜中性粒细胞控制。图A示出了嗜中性粒细胞（顶部）和正常未被攻击的细胞壁在C样品中攻击的位点的典型染色。白色念珠菌菌丝未被嗜中性粒细胞（底部）挑战。图B显示如何使用Axiovision软件中的感兴趣区域测量不同标签的荧光强度，以获得每个通道的平均荧光强度（MFI）。单个攻击部位和无嗜中性粒细胞对照部位之间的荧光强度比较的数据显示在图C中。除荧光强度的定量测量之外，显示给定表型的细胞的百分比（在成像的多个场上）也被定量。图D显示了E和F图中所示的两个单一视场的定量的代表性结果。在分析期间避免的菌丝末端的实例用白色括号（E-F）表示。更广泛的分析可以在Hopke等人，2016中看到。比例尺表示10μm（A）或20μm（E-F）。

图5. NET染色测定。针对MPO（A和插图）和瓜氨酸化组蛋白H3（C&插图）显示了NET染色测定的代表性结果。相应的仅次级抗体对照如下所示（B和D）。显示的面板包括用于Sytox绿色染色和MPO或瓜氨酸化H3染色的各个通道以及这些通道的重叠。刻度棒表示10μm（插图）或20μm（A-B，C-D）。

代表性成绩
NET组件的代表性染色结果如图5所示。白色念珠菌染色由CFW显示为蓝色。 Sytox的细胞外DNA染色显示为绿色。用MPO染色（图5A-5B）或瓜氨酸化的H3组蛋白抗体（图5C-5D）显示为红色。无原代（NP）对照显示红色通道中没有任何信号，表明染色过程中第一抗体的特异性（图5B和5D）。 MPO染色信号与细胞外DNA共同定位，但也直接在菌丝上，表明在NETs内部和外部与菌丝接触期间，MPO被嗜中性粒细胞释放（图5A，插图）。瓜氨酸组蛋白H3信号仅定位于细胞外DNA染色，表明它仅在NETs的上下文中被嗜中性粒细胞释放并与DNA紧密结合（图5C，插图）。使用所有三种经典NET标记物的染色共定位来证实在嗜中性粒细胞与菌丝孵育期间正在形成真正的NETs。
染色以检查真菌细胞壁损伤的代表性结果显示在图4A中，显示嗜中性粒细胞发生部位，增加CFW染色，强sDectin-1-Fc染色和Alexa Fluor 647缀合的链霉亲和素信号的丢失（图4A）。还显示了来自无嗜中性粒细胞对照样品的位点用于比较。这些对照显示正常菌丝细胞壁的表型。还显示了使用该方案进行的实验的数据分析的实例，包括在攻击和对照部位（图4B-4C）的不同细胞壁染色体的平均荧光强度（MFI）和显示细胞壁变化的活细胞的百分比图4D）从示例图像（图4E-4F）

食谱

PBS，pH 7.2
154 mM氯化钠
5.6 mM磷酸钠，无水二碱性
1.06mM磷酸钾，一水无水
将pH调节至7.2
高压灭菌20分钟液体循环
PBS + Na 2 CO 3，pH 8
制备1M的Na 2 CO 3，pH 10.5的溶液
向PBS中加入1/10体积以将pH增加至〜8以增强胺反应性化学物质
YPD肉汤
20 g/L BD Bacto蛋白胨
10g/L BD Bacto酵母提取物
20 g/L葡萄糖
用蒸馏水填充1L 液体循环时，在121°C高压灭菌20分钟注意：YPD琼脂与上述相同，加入20g/L BD Bacto琼脂。高压灭菌后，等待瓶子冷却至可以处理的位置，并通过向100 x 20 mm培养皿中加入25 ml熔融琼脂制成琼脂平板。储存于4°C直到准备使用。
PBS + 5％FBS
47.5毫升PBS
2.5 ml热灭活胎牛血清注意：我们通常将500毫升瓶子放置在55°C水浴中20分钟，对FBS进行热灭活。然后，我们通过加入2.5毫升至50ml锥形物将FBS预分装，并将其在-20℃下冷冻。然后可以在准备使用时将其解冻。这样做的两个管通常足够用于一个实验。
PBS + 2％FBS
24毫升PBS
16毫升PBS + 5％FBS
注意：您可以直接补充PBS + 2％FBS，也可以稀释一些您将按上述方法制作的PBS + 5％FBS。
PBS + 2％BSA
50ml PBS
1克Probumin ^®牛血清白蛋白诊断级粉末
注意：PBS + 2％BSA储存在4°C直到使用前。确保在打开盖子之前将其升温至室温，以防止瓶内水分冷凝。
RPMI + 5％FBS
RPMI 1640，含有25 mM HEPES和L-谷氨酰胺热灭活的胎牛血清
注意：这个解决方案每天都是新鲜的实验。所需金额将取决于当天运行的样本数量。
Tris-HCl，pH 8.0
1 M Tris碱基
用浓盐酸调节pH至8.0
TAC缓冲液（3ml，1分钟）
0.017M Tris-HCl，pH8.0
0.114 M NH 4 Cl
土耳其人解决方案
0.01％结晶紫色
3％乙酸

致谢

这项工作得到以下来源的资助：美国农业部（ME0-H-1-00517-13），美国国家卫生研究院（R15AI094406）和Burroughs Wellcome基金会Robert T. Wheeler博士。这份手稿是缅因州农林实验站出版号3481。

参考文献

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