材料和试剂

（Greiner Bio One International，目录号：227261）
细胞过滤器100μm（Corning，Falcon ^®，目录号：352360）
5ml移液器（VWR，目录号：VWR612-3702）
10 ml移液器（VWR，目录号：VWR612-3700）
25毫升移液器（VWR，目录号：VWR612-3697）
225ml管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352075）}
5毫升聚丙烯圆底管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352063）}
预分离过滤器30μm（Miltenyi Biotec，目录号：130-041-407）
Türk的解决方案（EMD Millipore，目录号：1092770100）
Lymphoprep ^TM（Alere Technologies，Axis-Shield，目录号：1114547）
台盼蓝染色（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15250061）
FcR阻断试剂（Miltenyi Biotec，目录号：120-000-442）
抗体

抗CD45-V450（BD，BD Biosciences，目录号：560367）
抗CD19-FITC（Dako Cytomation，目录号：F0768）
抗CD20-FITC（BD，BD Biosciences，目录号：345792）
抗CD56-FITC（BD，BD Biosciences，目录号：345811）
抗CD1c-PE（BDCA1）（Miltenyi Biotec，目录号：130-090-508）
抗CD14-PerCP（BD，BD Biosciences，目录号：345786）
抗HLA-DR-PE-Cy7（BD，BD Biosciences，目录号：335830）
抗CD4-APC-Cy7（BD，BD Biosciences，目录号：557871）
抗CD3-BV510（BD，BD Biosciences，目录号：563109）

乙二胺四乙酸（EDTA）（EMD Millipore，目录号：1084211000）
牛血清白蛋白（BSA）（Roche Diagnostics，目录号：10735108001）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Braun Melsungen，目录号：362 3140）
X-VIVO 15（Lonza，目录号：BE02-060Q）
抗生素/抗真菌药（AA）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15240062）}
人血清（HS）（Bloodbank Rivierenland）
0.5 M EDTA（参见食谱）
10％BSA（参见食谱）
稀释缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
染色缓冲液（见配方）
中等（见配方）

设备

离心机（Hettich Instruments，型号：Rotanta 460R）
细胞分选机（BD，型号：FACS Aria II）
磁力搅拌器（Heidolph乐器，型号：MR Hei-Mix S）

程序

从腹水中分离免疫细胞
1. 取四个50毫升管，并在其上面放置一个100微米的细胞过滤器
2. 移出细胞过滤器顶部的腹水并收集下面的50ml管中的腹水。将过滤的腹水转移到225ml Falcon管中。
  注意：过滤腹水会去除可能干扰细胞分离和细胞分选的组织，脂肪或血块。
3. 在4°C离心：
  最大加速度
  运行时间在490 x g 15分钟最大断点
4. 倒出上清液。注意，当存在大量红细胞时，颗粒容易脱离
5. 将沉淀重悬在稀释溶液中，用Türk溶液计数细胞（使用Türks：细胞比例为10：1）。将稀释缓冲液中的每10ml稀释细胞悬浮液至浓度为100×10 6个细胞。每50ml管加入10ml细胞悬浮液，用稀释液完成30 ml。
  注意：不要在Lymphoprep ^TM层的顶部放置超过100 x 10 ⁶的腹水衍生细胞，因为这可能会干扰细胞的分离
6. 在稀释的细胞下移液10 ml Lymphoprep ^{TM（图1A-1C）。使用10ml移液管吸取12 ml Lymphoprep ^TM。让吸管尖端沿着管的侧面小心滑动，直到其到达底部。从移液器男孩中取出移液器，然后等待Lymphoprep ^TM泄漏出来。拉出移液管直到尖端到达Lymphoprep ^TM层的顶部。将手指放在移液器顶部以关闭系统，并从管中取出移液器。在移液器中应该有大约2ml的Lymphoprep ^TM。}
7. 室温离心：
  加速时间240秒（R/1）
  运行时间20分钟在970
  不破坏
8. 用5ml移液管小心地移除间期，并将其收集在新的50ml管中（图1D）。用稀释溶液将体积减至50ml 注意：删除界面时要小心。握住吸液管尖端略高于界面。这样可以防止与间期层一起去除Lymphoprep ^TM溶液。
9. 室温离心：
  最大加速度
  运行时间10分钟，640 x x
  最大断点
10. 倒出上清液，将沉淀物重新悬浮于50ml洗涤液中
11. 在4°C离心：
  最大加速度
  运行时间在490
  的5分钟最大断点
12. 将细胞收集到一个50ml的管中，并用洗涤液重复洗涤，直到上清澄清注意：通常需要1或2个洗涤步骤，直到上清液清除。
13. 用台盼蓝染色（稀释细胞和台盼蓝比例为1：1）计数细胞。
  
  图1.密度梯度离心。 A.使用10ml移液管吸收12 ml Lymphoprep ^{TM。沿着管壁滑动吸头，直到达到底部。 B.从吸管男孩断开移液器，等待Lymphorpep ^TM泄漏出来。 C.小心地慢慢取出移液管。 D.离心后，根据其密度，免疫细胞积累在不同的层中。单核细胞（B细胞，T细胞，NK细胞，单核细胞）位于稀释缓冲液和Lymphoprep TM之间的间期。多形核细胞（粒细胞）可以在红细胞的顶部找到，其位于管底部。}
FACS染色
1. 4℃离心细胞：
  最大加速度
  运行时间在490
  的5分钟最大断点
2. 倒出上清液，用染色缓冲液稀释细胞至浓度为50×10 6细胞/ml。
3. 将50 x 10 ^{6细胞转移到新的50ml管中。}
4. 在4°C离心：
  最大加速度
  运行时间在490
  的5分钟最大断点
5. 倒出上清液。剩余液体的体积约为300μl
6. 加入50μlFcR封闭试剂（每1×10 6个细胞1μl），并在4℃下孵育5分钟。
7. 加入1 ml染色缓冲液，并在4°C离心：
  最大加速度
  运行时间在490
  的5分钟最大断点
8. 加入12.5μl抗HLA-DR-PE-Cy7（每1×10 6个细胞0.25μl抗体）和25μl剩余的每种抗体抗体（0.5μl抗体每1×10 6个细胞） sup-6细胞）：抗CD45-V450，抗CD19-FITC，抗-CD20-FITC，抗CD56-FITC，anit-CD1c-PE，抗CD14-PerCP，抗HLA- DR-PE-Cy7，抗CD4-APC-Cy7，抗CD3-BV510。
9. 在4℃和黑暗中孵育20分钟。
10. 加入10 ml染色缓冲液，并在4°C离心：
  最大加速度
  运行时间在490
  的5分钟最大断点
11. 倒出上清液，重复步骤B10两次。
12. 将细胞重悬于1ml染色缓冲液中注意：对于细胞分选，不要使用比50×10 6细胞/ml更高的浓度，因为这将导致由FACS Aria II测量的每秒钟太多的事件和干扰正确排序。
13. 在一个新的5毫升聚丙烯圆底管的顶部放置一个30微米的过滤器，并将细胞通过过滤器通入新管中。
  注意：将细胞通过30μm过滤器可以去除可能阻碍细胞分选机喷嘴的细胞团。
14. 用1ml培养基准备三个5ml聚丙烯圆底管，分选后收集细胞
细胞分选
1. 细胞分选在室温下进行。分拣机内的收集管保持在4°C 注意：在冰上分选之前和之后保留细胞以增加细胞活力。
2. 选择FACS Aria II上的85μm喷嘴，以减少分选细胞的压力。
3. 使用以下门控策略对不同的细胞群进行分类（图2）
4. 用1 ml培养基将细胞收集在5ml聚丙烯圆底管中注意：在收集细胞之前摇动圆底管，用介质覆盖管表面。这样可防止细胞粘附在管壁上。
  
  图2.使用荧光激活细胞分选分离免疫细胞亚群的门控策略。 A.在FSC/SSC图上的免疫细胞门控; B和C.单细胞选择; D.对免疫细胞群进行门控，其为CD45-V450阳性（G4），从而排除B细胞和NK细胞。可以根据HLA-DR-PE-Cy7和CD14-PerCP的表达鉴定不同的免疫细胞群体。骨髓来源的抑制细胞是CD14抗体，HLA-DR 。 F.从门G5，鉴定并分离CD3 ⁺ CD4 ⁺ T细胞。 G.GG G6（HLA-DR ⁺ CD14 ^-）用于鉴定BDCA1 ⁺细胞。细胞（P2）可以进一步细分为CD14 ⁺和BDCA1 sup> + CD14 ⁺单元格。

数据分析

来自腹水的分离的免疫细胞亚群可用于不同的实验，如混合淋巴细胞反应，抑制试验或抗原摄取测定法，如Bakdash等人，2016年所公布。

笔记

由于可以收集大量的腹水，因此首先将其旋转以便使细胞富集并将其溶解在较小体积中。
Lymphoprep ^TM必须防止光照，并在室温下储存，以确保良好的分离。
在室温下保持稀释溶液和EDTA
10％BSA和洗涤液需要在4℃下储存。
当制备0.5M EDTA时，重要的是要注意，EDTA仅溶于pH为8.
FITC用作转储通道。三种FITC标记抗体CD19，CD20和CD56用于排除B细胞和NK细胞

食谱

注意：所有缓冲液和稀释液在推荐温度下储存时都是稳定的，并在无菌条件下使用。

0.5 M EDTA（储存于室温）
186.1g EDTA
800ml dH 2 O O
在磁力搅拌器上剧烈搅拌并调节pH至8.0
带dH <2> O
将音量调至1L
10％BSA（4℃储存）
10克BSA
100毫升PBS
稀释缓冲液（在RT存储）
5 ml 0.5 M EDTA
500毫升PBS
洗涤缓冲液（在4℃下储存）
5 ml 0.5 M EDTA
5 ml 10％BSA
500毫升PBS
染色缓冲液（储存于4°C）
PBS
1％BSA
1％EDTA
中等（储存于4°C）
100 ml X-VIVO 15
1 ml AA
2毫升HS

致谢

这项工作得到荷兰科学研究组织（NWO）和荷兰再生医学研究所（NIRM，FES0908）的授权951.03.002的支持。 IJMdV是NWO Vici授权的收件人918.14.655。
从用于分离PBMC的标准方案改变从腹水中分离单核细胞的程序（Bakdash等人，2016）。

参考文献

Bakdash，G.，Buschow，SI，Gorris，MA，Halilovic，A.，Hato，SV，Skold，AE，Schreibelt，G.，Sittig，SP，Torensma，R.，Duiveman-de Boer，T.，Schroder， C.，Smits，E.L，Figdor，CG，de Vries，IJ（2016）。扩增黑素瘤患者的BDCA1 ⁺ CD14 ⁺骨髓细胞群体可能会减弱树突状细胞疫苗的功效。 em> Cancer Res 76（15）：4332-4346。
Jelovac，D.和Armstrong，DK（2011）。卵巢癌的诊断和治疗方面的最新进展癌症J Clin 61（3）：183-203。
Kipps，E.，Tan，DS和Kaye，SB（2013）。满足卵巢癌腹水的挑战：治疗和研究的新途径。 Nat Rev Cancer 13（4）：273-282。
Lengyel，E.（2010）。卵巢癌发展和转移。 Am J Pathol 177（3）：1053-1064。
Tan，DS，Agarwal，R.和Kaye，SB（2006）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17081918"target = "_blank">卵巢癌转移瘤的机制。"柳叶刀Oncol"7（11）：925-934。