材料和试剂

移液器提示
20μl（StarLabs，TipOne ^®，目录号：S1110-3800）
200μl（StarLabs，TipOne ^®，目录号：S1111-0806）
1000μl（StarLabs，TipOne ^®，目录号：S1111-6801）
Corning 15 ml PP离心机无菌管（Corning，目录号：430791）
细胞培养瓶75厘米2（VWR，目录号：734-0012）
96孔板平底（VWR，目录号：734-0023）
THP1-BlueTM NF-κB细胞（InvivoGen，目录号：thp-nfkb）
阳性对照：来自E的LPS。大肠杆菌，血清型EH100（Ra）（TLRgrade ^{TM）（Enzo生命科学，目录号：ALX-581-010-L002）}
测试炎症刺激：例如重组腱生蛋白-C蛋白或腱生蛋白-C蛋白的纤维蛋白原样球状结构域（FBG）（如Midwood等人，2009中所述合成）
罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640与L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：BE12-702F）
胎牛血清（FBS），合格的，热灭活的（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10500064）}
青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
Normocin ^TM（InvivoGen，目录号：ant-nr-1）
盐酸杀菌素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：R21001）}
QUANTI-Blue ^TM（InvivoGen，目录号：rep-qb1）
不含杀稻瘟素的ThP1培养基（见食谱）
ThP1介质与杀稻瘟素（见食谱）
QUANTI-Blue ^TM解决方案（请参阅食谱）

设备

P20，P200和P1000移液器
37°C水浴
血细胞计数器
CO ₂孵化器
FluoStar欧米茄读卡器
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus ^TM MAgefuge ^TM 16）
转子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：TX-400 4 x 400 mL摇摆转筒，目录号：75003629）}

软件

图垫棱镜

程序

细胞培养条件
1. 在37℃水浴中解冻含有3-7×10 6个THP1-Blue ^TM NF-κB细胞的小瓶。
2. 将细胞转移到含有10ml预热的ThP1 NF-κB培养基的15ml无菌管中，不含杀稻瘟素（见食谱）。离心管320×g，持续5分钟。
3. 除去上清液并将细胞重悬于10ml无杀稻瘟素的ThP1 NF-κB培养基中。使用血细胞计数器计数细胞。
4. 将1×10 6个细胞在不含杀稻瘟素的10毫升ThP1 NF-κB培养基中转移至75厘米2细胞培养瓶中，并将培养物在37℃下放置5％ CO ₂。
5. 细胞生长悬浮。为了通过细胞，将细胞转移到无菌的15ml管中，并使用血细胞计数器测量细胞浓度。在室温下将320g离心管放置5分钟，除去细胞上清液并将细胞重新悬浮于新鲜培养基中。每3天通过细胞，不要让烧瓶中的细胞浓度超过2×10 6细胞/ml。
6. 对于前两代，细胞应在不含杀稻瘟菌素的培养基中培养，以使其从冷冻中恢复。第二次传代后，用杀稻瘟素培养ThP1 NF-κB培养基中的细胞（参见食谱）以维持选择压力。
细胞刺激
1. 将细胞转移到15 ml无菌管中。以320g离心细胞5分钟。去除上清液并将细胞重新悬浮于新的具有杀稻瘟素的ThP1 NF-κB培养基中
2. 在平底96孔板中以100μl的最终体积每孔1×10 5个细胞。
3. 电镀后，立即通过加入稀释在100μl一式两份或一式三份孔中的培养基中的LPS或重组蛋白（例如，FBG）来刺激细胞。每个孔的最终体积为200μl。
4. 在37℃下在5％CO 2中孵育细胞24小时（见注3）。
5. 测量NF-κB诱导的分泌性碱性磷酸酶，收集细胞上清液
6. 在这个阶段，细胞可以用于评估生存力，例如通过MTT测定
NF-κB活化的测定
2. 每孔加入180μlQUANTI-Blue ^{TM至平底96孔板。}
3. 向每个孔中加入20μl的THP1-Blue ^{TM细胞上清液。}
4. 在37℃孵育2小时。在分泌的胚胎碱性磷酸酶的存在下，培养基将从粉红色变为蓝色（图1）
5. 通过使用分光光度计读板器读取620nm处的光密度（OD）来确定SEAP水平
  
  图1.使用QUANTI-Blue 检测分泌的胚胎碱性磷酸酶。以降低剂量的活性激活THP1-Blue NF-κB细胞LPS加阴性对照（NC）重复进行。在SEAP的存在下，QUANTI-Blue ^TM媒体将颜色从粉红色变为蓝色。蓝色强度与不同剂量的NF-κB活化相关

数据分析

对于每个刺激，绘制OD值的平均值±平均值的标准误差（SEM），在多个独立实验（图2）的情况下，或OD值的平均值±标准偏差（SD），在单个情况下实验。数据也可以表示为与非刺激细胞相比的折叠变化差异。使用Graph Pad Prism或其他软件进行统计分析。

图2.在THP1-Blue NF-κB细胞中，通过LPS或腱生蛋白-C（FBG-C）的FBG结构域的NF-κB活化。细胞用使用QUANTI-Blue 测量不同剂量的LPS或FBG-C或未被刺激的（ - ）和24小时NF-κB活化后。数据显示为平均值±SEM，N = 3次独立实验。单因素方差分析与Dunnett的事后检验无刺激相关， 0.05，** P 0.01， *** P 0.001。使用Graph Pad Prism进行统计分析。

笔记

QUANTI-Blue ^TM信号可以在加入细胞上清后15分钟至24小时检测。确定测量QUANTI-Blue ^TM信号的最佳时间点，以便能够在独立实验之间进行比较。
TLP1-Blue ^TM NF-κB细胞对TLR1/2，TLR2/6，TLR4，TLR5，TLR8，NOD1和NOD2激动剂的稳健反应。然而，TLR3，TLR7和TLR9配体的反应差。
可以在TLR4配体细胞刺激后8 h检测到健壮的SEAP信号（图3）。然而，建议滴定感兴趣的刺激物，以确定刺激后评估NF-κB活化的最佳剂量和时间点。

图3：THP1-Blue NF-κB细胞中NF-κB活化的时间过程细胞用1ng/ml LPS或1μMFBG-C并且在不同时间点使用QUANTI-Blue TM测量NF-κB活化。数据显示为平均值±SEM，N = 3次独立实验。单因素方差分析与时间0小时，Dunnett的事后检验，* 0.05，** P < 0.01，*** 0.001。

致谢

我们感谢Anna Marzeda提供图1中使用的图像。这项工作得到了英国关节炎研究和肯尼迪风湿病研究信托基金的支持。该协议首次在Piccinini等人发布。（2016），并且还在以下正在审查中的手稿（Zuliani-Alvarez等人，2017年）中具有特征。作者宣称它们没有影响本协议的设计和实施的利益冲突或竞争利益。

参考文献
1. Midwood，K.，Sacre，S.，Piccinini，AM，Inglis，J.，Trebaul，A.，Chan，E.，Drexler，S.，Sofat，N.，Kashiwagi，M.，Orend，G.，Brennan ，F.和Foxwell，B.（2009）。腱生蛋白-C是Toll样受体4的内源性激活剂，其对于维持关节炎关节疾病中的炎症是必需的。 15（7）：774-780。 >
2. Piccinini，AM，Zuliani-Alvarez，L.，Lim，JM和Midwood，KS（2016）。独特的微环境提示刺激巨噬细胞中不同的TLR4介导的信号通路。 9（443）：ra86。
3. Zuliani-Alvarez，L.等人。（2017）。揭示危险的分子决定因素：如何通过收费样受体4检测腱生蛋白C（综述）。