材料和试剂

1.5ml Eppendorf管（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：05-408-129）
移液器提示（USA Scientific，目录号：1112-1720,1110-1200）
拟南芥植物（生态型Col-0）
Ponceau S（Sigma-Aldrich，目录号：P3504）
抗α-微管蛋白（Beyotime Biotechnology，目录号：AT819）
抗肌动蛋白（Abmart，目录号：M20009）
抗COXII（Agrisera，目录号：AS04 053A）
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（AMRESCO，目录号：0511）
醋酸钾（国药化学试剂，目录号：30154518）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma，目录号：63064）
吐温20（AMRESCO，目录号：0777）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：V900502）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（EMD Millipore，目录号：52332）
K-HEPES蛋白提取缓冲液（参见食谱）

设备

杵（VWR，目录号：89093-446）
镊子（上海海鸥）
移液器（VWR，目录号：89079-970,89079-974）
涡旋（Corning，型号：Corning ® LSE TM 涡旋混合器）
离心机（Eppendorf，型号：5417 R）

程序

在长达21天的条件下（16小时光/8小时黑暗）在21℃的生长室中种植拟南芥植物6至8周。通常，Col-0生态型将在这些条件下产生许多花。可以改变植物生长时间以适应其他拟南芥生态型的开花时间。
在一个1.5ml Eppendorf管中快速收集100多个新鲜开花（图13-15，图1），并加入1ml K-HEPES蛋白提取缓冲液（参见食谱）。这个步骤可以在室温下完成。
注意：上午10点左右收集拟南芥花。此时，花朵将被完全打开，可以更容易地进入花粉。

图1.第13-15阶段的开花拟南芥花/（Müller，1961; Smyth等，1990）
以最高速度旋转花朵2-5分钟，以便将花粉与鲜花完全分开（视频1）。

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视频1.在步骤3中通过涡流从花中分离花粉的步骤

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在4℃下以350 x g离心1分钟（视频2）。
注意：在低速下，大多数花朵将悬浮在上层缓冲液中，但花粉将被离心至管底。

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视频2.如步骤4-7所述分离蛋白质的步骤

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用小镊子缓慢地彻底清除所有的花卉碎片（视频2）。
注意：如有必要，您可以重复步骤4和5，以完全去除花粉碎物，但您应注意避免接触管底部的花粉。
彻底清除上清液（视频2）注意：确保花粉仍在管的底部。
将管放在冰上，用小杵彻底研磨花粉1-3分钟（视频2）。如果花粉完全匀浆，液体混合物会变黄注意：如果您的实验室没有1.5毫升管的合适的杵，您可以使用1毫升吸头，将其熔化在火焰中，作为替代物。
将50μlK-HEPES蛋白提取缓冲液加入管中，并将管保持在冰上约1 h
在4℃下以18,000xg离心20分钟，然后将上清液转移到新的1.5ml管中（将管保持在冰上）。重复此步骤两次。上清液是最终的花粉蛋白质样品，蛋白质浓度可以通过标准Bradford测定法测定

数据分析

拟南芥花粉总蛋白的SDS-PAGE和Western印迹分析显示在图2中。从拟南芥分离的总蛋白质玫瑰花叶，其中Rubisco的小亚基是远最丰富的组分被用作对照（图2A）。相比之下，在花粉总蛋白中几乎不检测到与Rubisco的小亚基相对应的条带（图2B）。这意味着在拟南芥总蛋白提取物中检测Rubisco小亚基以外的蛋白质可能更容易。例如，通过每泳道加载10μg花粉总蛋白，可以容易地检测到α-微管蛋白（TUA），肌动蛋白（ACT），细胞色素c氧化酶亚基II（COXII）和profilin（PRF）（图2B）。 />

图2.从拟南芥花粉和叶分离的总蛋白质的SDS-PAGE分析，以及用几种抗体探测的拟南芥花粉总蛋白的蛋白质印迹分析强> A.从拟南芥分离的总蛋白（50μg）的玫瑰花叶的SDS-PAGE分析。蛋白转移后，硝基纤维素（NC）膜用Ponceau S染色。 B.左图显示从拟南芥花粉分离的总蛋白（10μg）的SDS-PAGE分析。蛋白转移后，NC膜用Ponceau S染色。右图显示用抗α-微管蛋白，抗肌动蛋白，抗COXII和profilin抗体探测的拟南芥花粉总蛋白的蛋白质印迹分析。 profilin抗体在我们的实验室中产生;请参阅我们发表的论文（Liu等人，2015年）中的细节。其他抗体可商购：抗α-微管蛋白（Beyotime Biotechnology，AT819），抗肌动蛋白（Abmart，M20009）和抗COXII（Agrisera，AS04 053A）。

笔记

一般来说，100个Col-0花将通过该方法产生约100μg总花粉蛋白。

食谱

K-HEPES蛋白提取缓冲液
20mM HEPES，pH 7.0
110 mM醋酸钾 2mM MgCl 2
0.1％吐温20
0.2％Triton X-100
1毫升PMSF（使用前立即添加）
注意：此缓冲液（不含PMSF）可在4°C下储存长达6个月。

致谢

这个协议是从我们以前发表的作品中修改的（Chang and Huang，2015）。黄实验室的工作得到了中国科技部（2013CB945100）和国家自然科学基金（31671390和31471266）的资助。

参考文献

Chang，M.和Huang，S。（2015）。拟南芥 ACT11修饰肌动蛋白周转率以促进花粉萌发并维持正常的管生长速率。植物J 83（3）：515-527。 />
Chen，N.，Qu，X.，Wu，Y.and Huang，S。（2009）。花粉管中肌动蛋白动力学的调节：肌动蛋白聚合物水平的控制.J Integr Plant Biol 51（8）：740-750。 br />
Liu，X.，Qu，X.，Jiang，Y.，Chang，M.，Zhang，R.，Wu，Y.，Fu，Y.and Huang，S。（2015）。< a class = profilin调节顶端肌动蛋白聚合以控制极性花粉管生长。莫尔工厂 8（12）：1694-1709。
Müller，A.（1961）。 Zur Charakterisierung derBlütenund Infloreszenzen von 拟南芥（L.）Heynh。 Kulturpflanze 9（1）：364-393。
Qu，X.，Jiang，Y.，Chang，M.，Liu，X.，Zhang，R.and Huang，S。（2015）。花粉管中肌动蛋白细胞骨架的组织和调控。前植物科学 5：786 。
Smyth，DR，Bowman，JL和Meyerowitz，EM（1990）。拟南芥中的早期花卉开发植物细胞 2（8）：755-767。