材料和试剂

10μm厚双面胶带（D80 19 x 50 mm）（Modulor，目录号：0332054）
盖板21 x 26 mm（No.1）（Thermo Fisher科学，Thermo Scientific ^TM，目录号：BBAD02100260＃A *）
用于细胞培养的6孔板（SARSTEDT，目录号：83.3920）
15ml反应管（例如，SARSTEDT，目录号：62.554.502）
200微升移液器吸头（例如，Greiner Bio One International，目录号：739290）
硅管
柔性硅管（内径[id] 2mm;外径[od] 4mm和标准1.5mm; od 3mm）（例如，VWR，目录号：228-0704和228- 0702）
感兴趣的细胞系和合适的细胞培养基
注意：该方案迄今为止已经测试了附着增长的细胞系HeLa（ATCC，目录号：CCL-2），MDCK（ATCC，目录号：CCL-34），COS-7（ATCC，目录号：CRL-1651），MCF7细胞（ATCC，目录号：HTB-22）和HCT116（ATCC，目录号：CCL-247）。其他细胞系可以在适当测试冷冻阻滞的可逆性之后使用。
乙醇，绝对（例如，Fisher Scientific，目录号：10342652）
无菌水（通过过滤灭菌）
DMSO（最小99％）（例如，Serva Electrophoresis，目录号：20385）
液氮
浸油（例如，奥林巴斯，目录号：IMMOIL-F30CC）
表达感兴趣的荧光蛋白的转染试剂和质粒稳定表达感兴趣的荧光蛋白的细胞系。该协议已经成功地用于具有构象活性传感器的共聚焦FLIM，用于EphrinA2和EGFR标记的mCitrine与与mCherry标记的磷酸酪氨酸结合结构域结合。已经用EGFR-mEos2和标记为SNAP-Tag的Vinculin进行单分子定位，并用SNAP细胞TMR-星（New England Biolabs，目录号：S9105S）标记。有关这些质粒的请求可以发送给相应的作者
HEPES或不含酚红的磷酸盐缓冲成像介质（例如，DMEM，PAN-Biotech，目录号：P04-01163）
10％胎牛血清（FBS）（PAN-Biotech，目录号：P30-1505）
链霉素/青霉素（PAN-Biotech，目录号：P06-07100）
L-谷氨酰胺（200mM）（PAN-Biotech，目录号：P04-80100）
1％非必需氨基酸（PAN-Biotech，目录号：P08-32100）
不同的DMSO溶液（参见食谱）
细胞培养基（参见食谱）

设备

Scalpel
层流罩
孵化器（例如，，Nuaire，型号：NU-5510/E）
细镊子（例如，电子显微镜科学，目录号：0203-7-PO）
阳极氧化（黑色）铝流通室（定制;见图1）
注意：阳极氧化铝减少其腐蚀，从而降低铝离子的溶解度，否则可能会影响细胞反应。黑色阳极氧化可减少光的反射，这可能会影响显微成像。

图1.流通室的设计。由铝制成的自建式流通室的摄影表示（A，B）和技术图纸（C-E）。 A.流通室的俯视图，其中移液管插头插入入口（1）和钻孔（2;深度：15mm;直径：1mm），用于插入热电偶。 B.底视图，盖玻片胶合到流通室（3）; C.流通室的俯视图; D.通过流通室的侧视图部分（C节中的a节：a）; E.侧视图部分的详细信息（D中的详细信息b）。 c-e中的所有尺寸均为mm。
用于显微镜台的聚氯乙烯（PVC）插件（定制;见图2），带有2个螺纹孔，以使用金属夹固定平台（参见图3B）

图2.用于显微镜平台的PVC插入件的技术图纸。技术图纸显示了适用于Scan IM阶段的安装（MärzhäuserWetzlar GmbH& Co. KG，Wetzlar，Germany）。 A.底视图B.侧视图（a：a in A）; C.中央部分的侧视图（B中的b）。所有尺寸均为mm。
具有计算机接口的低压注射泵（Cetoni，型号：neMESYS低压注射泵）
具有温度控制的冷冻阶段（Linkam Scientific，型号：MDS600，具有类似冷却头的其他型号也可以工作）
具有连接到计算机用于连续温度记录的数据采集设备（例如，，具有0.08mm电线的PTFE绝缘型T;欧米茄工程公司，Deckenpfronn，德国）的热电偶（例如， >，OMEGA工程，型号：OMB-DAQ-2408-2AO）
对于共焦FLIM：配备时间相关单光子计数单元和ps脉冲激光（例如，PicoQuant，型号：MicroTime 200）的共焦激光扫描显微镜
对于SMLM：配有敏感摄像机（EMCCD或sCMOS）的显微镜以及具有足够波长和功率的激光器进行成像，打开和漂白荧光团
倒置显微镜（Olympus，型号：IX-81）

图3.安装在显微镜上的冷冻阶段安装在倒置显微镜（IX-81; Olympus GmbH，Hamburg，Germany）上的低温阶段的照片表示。 A.在显微镜下使用周边仪器进行低温阶段的概述。 1：具有控制单元的液氮泵（注意：这通常与光学平台断开，因为它可能会导致样品的振动）; 2：具有不同DMSO浓度的培养基的15ml管，低压注射泵的入口管经由具有孔的盖插入; 3：低压注射泵; 4：热电偶数据采集装置; 5（B）中详细说明的低温阶段的中部; 6：液氮储层。 B.显微镜中央部分的详细图像。 1：管连接氮气泵; 2：将金属夹固定在PVC插件上; 3：热电偶测量银块内的温度; 4：中等入口连接低压注射泵; 5：铝流通室（比较图1）; 6：显微镜载物台用PVC插片（比较图2）; 7：管连接到氮气池; 8：带电加热器的温控银块; 9：中出口管; 10：测量铝块温度的热电偶。

软件

ThunderSTORM插件（Ovesny，Bioinformatics，2014）
ImageJ（Rasband，ImageJ，National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA）

程序

细胞培养
注意：以下步骤应在层流罩下进行。所有仪器均应先消毒。胶带应仅在层流罩下方从其包装中取出。

使用手术刀将双面胶带切成26毫米长的片（图4A）。
注意：使用一层带隔离衬垫的胶带作为支撑。然后，在顶部添加第二层，并将其切成大小。这样便于使用胶粘带，因为它不会粘附到剥离衬垫上。

图4.具有盖玻片的培养皿的制备 A.将一层双面胶带（1）胶合在光滑表面上（例如，阳极氧化铝板）。将第二层双面胶带胶合在顶部（2）上并切割成盖玻片（左图）的长度。之后，一个矩形的应用程序21 x 5 mm在中心切出并取出（右图）。 B.双面胶带粘贴在封面滑块上（4;左图）。轻轻按压确保紧密接触并防止泄漏（右图）。 C.具有带有双面胶带（箭头）的带盖玻片的6孔细胞培养皿在具有酚红的细胞培养基中的照片表示。双面胶带具有穿过流通室的空腔的切口（箭头;比较图1B）。

使用手术刀在每片胶带的中间切出一个21 x 5毫米的矩形，并拆下内部矩形（图4A）。

将胶带粘在21 x 26 mm的盖子上。轻轻按下以确保紧密接触，而不会破坏盖板滑块（图4B）。

通过将盖子浸在乙醇中并用无菌蒸馏水清洗盖子来消毒。

将盖板放在6孔板中（图4C）。

分离培养的细胞并将其置于普通细胞培养基中的6孔培养皿中（参见图4）。胶带不受细胞培养基的影响，并保持粘稠注意：在加入细胞之前，让盖子用细胞培养基干燥或洗涤，因为蒸馏水对细胞有害。

至少在37℃/5％CO 2下孵育直到它们牢固地附着。细胞可在此条件下培养数天，并用相关的感兴趣的构建体进行转染
在显微镜下组装低温阶段

在成像介质中，在15 ml反应管中制备10％，20％，30％和50％（体积/体积）的DMSO溶液。
注意：低温注射泵的入口管可以通过盖子上的一个孔插入15ml反应管中（图3A）。

将银冷却头从低温阶段的外壳中取出。

使用柔性硅管（i.d. 2 mm; o.d. 4 mm）和电子温度控制将氮气泵，液氮储存器连接到银冷却头（见图3B）。

使用液氮泵的控制单元将银块的温度设置为37°C（图3A-1）。

将一块柔性硅管（i.d. 1.5 mm; o.d. 3.5 mm）连接到低压注射泵的出口。
注意：连接到注射泵的管的体积不应超过200μl。否则，这将增加在每次冷冻逮捕的每一步中需要交换的媒体数量。

使用自动化注射器的软件，将注射器和管与成像介质无DMSO填充。避免气泡。
注意：对于第一次灌装，必须在注射器中填充少量培养基，并将其压出其出口，以便在注射器内注入去除注射器和管内的气泡。

将PVC插入物组装到显微镜台上，将目标置于流通室的开口下方（图3B）。

从底部通过流通室的入口和出口按200微升移液管吸头。用手术刀清除从底部伸出的部位。此外，用剪刀切割移液管尖端的锥形端的几毫米（比较图1A和1B）。
将细胞安装到低温阶段
注意：步骤C1-C4必须快速执行，以保护细胞免受干燥。

用胶带将盖子滑块和生长在其上的细胞从6孔板上取出

用精细镊子取下释放衬垫。

将封盖滑块胶合到流通室，使中间的切口适合流通室的空腔（图1B）。

通过移液通过连接到流通室的移液管尖端之一来将流通室填充到常规的细胞培养基中。填充房间和两个移液器吸头完全。避免气泡。

将流通室放置在PVC插件的空腔中（图3B-5和3B-6）。

将硅管从注射泵连接到流通腔的移液管尖端之一（图3B-4）。

将一块硅管（i.d. 1.5 mm; o.d. 3.5 mm;长度≤100 mm）连接到另一个吸头，并在硅管开口端下方放置一个空培养皿（图3B-9）。

在铝室顶部放一小滴油（例如浸油），并使用金属夹将冷却头安装在其上（图3B-2和3B-9） >

将热电偶连接到铝合金平台的钻孔中。开始温度测量。测量温度应高于36°C，如果热电偶与铝合金室接触良好。
可逆冷冻
1. 在刺激后的特定时间止血细胞，再次用冷冻停止循环再次开始。在EGF刺激之前和之后，通过光激活定位显微镜在HeLa细胞中定位的EGFR的实例显示在图5中。更多的例子显示在方法的最初出版物（Masip等人，2016）中。。
  
  图5.刺激前后相同HeLa细胞中EGFR的光激活定位显微镜。显示了在（左图）和5周前冷冻缓冲的EGFR-mEos2转染的HeLa细胞的定位图分钟后（右图）刺激200ng/ml EGF。在可逆冷冻抑制下，EGFR分子通过光激活定位显微镜定位，精确度为21±6nm（平均值±SD）。刻度棒=5μm

数据分析

几乎所有的荧光显微技术都可以兼容冷冻阻滞。因此，数据分析将取决于在冷冻停止下进行的显微镜检查。迄今为止，SMLM和FRET-FLIM已经应用了可逆的冷冻逮捕。关于分析的详细信息可以在免费提供的Masip 等的版本，2016（Europe PubMed Central plus，Manuscript＃69708）中找到。简而言之，SMLM图像可以使用ImageJ（Rasband，ImageJ，National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA）的ThunderSTORM插件（Ovesny，Bioinformatics，2014）来重建。对于FRET-FLIM数据，建议通过全局分析来量化图像中每个像素中经历FRET的荧光分子的分数（Grecco等人，2009）。

笔记

在本协议中，我们专注于冷冻停滞的应用研究贴壁生长哺乳动物细胞中的RTK激活。在测试细胞中，保留了一般形态。他们没有诱导应激反应基因的表达，并且生长因子诱导的信号通常在冷冻阻滞后进行（Masip等人，2016）。该方案可能适用于各种类型的生物样品和过程。然而，当在新的实验室中建立可逆的冷冻阻滞或使用不同的细胞系统时，建议进行控制以确保冷冻停止不会影响所产生的数据。应进行至少三次具有荧光标记细胞的不同实验（例如，通过转染荧光蛋白如EGFP），以判断其形态。冷冻停止后，细胞应用染色污染细胞（例如，碘化丙啶）的染料标记。死细胞可通过将死细胞标记物阳性的荧光标记细胞数除以荧光标记细胞的总数来量化。此外，应测试冷和热应激蛋白的表达，并且正在进行和不进行冷冻抑制来量化正在研究的反应以排除冷冻停滞程序对所研究的方法的影响（Masip等人， em>。，2016）。

食谱

不同的DMSO溶液（10％，20％，30％和50％[vol/vol]）
通过将不含酚红的DMSO和HEPES缓冲介质以相应的比例吸移到15-ml反应管中并反转管数次来制备不同的DMSO溶液
细胞培养基（用于设备部分所示的细胞系）
含有补充有10％胎牛血清（FBS），100μg/ml链霉素加100μg/ml青霉素的酚红的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），1 ％L-谷氨酰胺（200mM）和1％非必需氨基酸

致谢

作者要感谢Michael Reichl和Petra Glitz的优秀技术支持，Max-Planck分子生理学研究所的研讨会，用于构建定制零件，AstridKrämer对原稿的严格校对和SvenMüller的设置摄影图像。这项研究由弗劳恩霍夫协会和马克斯普朗克科学促进会共同倡议"冷冻系统"和欧洲研究委员会（ERC AdG 322637）资助。该协议基于以前发布的协议（Masip 等人，2016）。

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