材料和试剂

12毫米玻璃盖玻片＃1（VWR，目录号：631-0713）
网格盖玻片（可选）（电子显微镜科学，目录号：72265-12）
猎鹰24孔板（康宁，目录号：353047）
永久标记（Faber-Castell Multimark 1523）（CultPens，目录号：FC19628）
1 mL注射器（BD，目录号：303172）
25 G 1½针（BD，目录号：305127）
来自ATCC的上皮Madin-Darby犬肾（MDCK II）（ATCC，目录号：CRL2936）
表达荧光中心体定位蛋白（例如，樱桃微管蛋白，Addgene，目录号：49149）的DNA构建体
Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D5796）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
青霉素 - 链霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11668027）}
汉克的不含酚红的平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：H8264）
1 M HEPES溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15630080）}

设备

高压灭菌器
镊子（精细科学工具，目录号：11251-20）
LSM 710共聚焦显微镜（ZEISS，型号：LSM 710）或任何其他反相共聚焦显微镜，分别为25x和40x油目标，数值孔径分别为0.8和1.3
贴片钳（Axon Instruments）
显微镜BX51（Olympus，型号：BX51）
硼硅酸盐玻璃与细丝移液管制造。外径：1.5mm，内径：0.86mm，长度10cm（Linton Instrumentation，目录号：BF150-86-10）
CO 2细胞培养箱（Thermo Electron Corporation）
P-97火焰/棕色微量吸管拔出器（Sutter Instruments，型号：P-97）
Sutter MP-225电动显微操纵器（Sutter Instruments，型号：MP-225）

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij ，国立研究所的健康）

程序

使用永久标记，在不同的设备之间移动时，用小圆圈和一个额外的标记标记圆形盖玻片以保持盖玻片的相同取向（图2）。高压灭菌盖子以避免污染。
注意：不使用标有永久性标记的盖玻片，网格盖玻片可用于亚汇合细胞培养。然而，在汇合的完全极化单层中，网格可能难以可视化。

图2.圆形盖玻片标有生成细胞图的永久标记
将盖玻片放入24孔板中，将20万个MDCK细胞种植到盖玻片上，盖玻片应定向，使未标记的一面位于顶部。在补充有5％胎牛血清，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM中培养细胞。
第二天用与GFP或mCherry等荧光蛋白基因融合的中等体定位蛋白（例如，PRC1，MKLP1或微管蛋白）转染MDCK细胞。如果使用稳定转染的细胞，20-60％之间应该表达转基因。可以用未转染的细胞稀释细胞以达到这一目的。具有20-60％的表达转基因的细胞是重要的，以具有独特的细胞图，允许在稍后阶段容易地取向细胞图。使细胞生长至少两天，以使细胞分裂并随后产生新的中等体。
注意：我们建议根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000试剂转染MDCK细胞。在本协议中，我们使用20万个细胞，1μgDNA和1μlLipofectamine 2000 /孔。
对于细胞图，使用低倍率下的共焦显微镜对位于圆内的细胞进行成像（图3）。打印图像，让它们在以后的步骤中被用来参考。
注意：为了生成单元格图，我们使用25x的目标。

图3.细胞图和midbody可视化的生成使用稳定表达GFP-微管蛋白的细胞。细胞图在最左边使用25x物镜表示。盒装区域显示具有40x物镜的放大倍数，并用于定位显示中等体的细胞。注意，中心体位于顶端表面。白色的箭头标记了中部残余物。比例尺= 10μm
随后，选择一些细胞以更高的分辨率进行成像，记录中间体残留物的存在，然后用膜片钳装置进行手术。适于中间残留移除的细胞将残留物置于顶端细胞表面（图3;视频1）。使用笔，记录打印图像上成像的单元格。
注意：注意避免光漂白。将焦平面移动到细胞单层的顶端表面，以发现中间残留物。

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视频1.在TUSP之前稳定表达GFP-微管蛋白的MDCK细胞的Z-叠图像。图像从基底外侧显示为顶端膜（即从底部到顶部）。白色的箭头指向中部残余物。请注意，残留物位于顶端细胞表面。

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将样品转移到膜片钳装置（图4）。用补充有0.5％胎牛血清，HEPES 20mM，pH 7.2-7.5,50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的HBSS培养基填充膜片钳装置的腔室，并将盖玻片放入室中。为了更容易地检测先前成像的区域，请使用盖玻片上的标记位置以与先前用于生成细胞图的方向相同的方向放置样品。

图4.耦合到落射荧光显微镜的夹钳装置
使用印刷细胞图作为参考，识别先前在耦合到膜片钳装置的落射荧光显微镜下圆圈内成像的细胞。
注意：在此步骤中，使用低倍率目标。
一旦细胞图被正确定向，使用更高放大倍率的目标，并沿着XY轴移动到之前记录中间体残余的细胞的位置。仔细检查残留物的存在。
注意：在我们的荧光显微镜下，这个步骤是用60x的目标进行的。快速查看残留物并关闭荧光通道以避免光漂白。
移动目标以允许玻璃移液管在物镜和单层之间。
为了制造玻璃移液管，将外径为1.5mm，内径为0.86mm，长度为10cm的硼硅酸盐玻璃移液管装入微量移液管拉拔器（图5）。斜坡值= 515-535;拉= 0;速度= 15-25; 4个加热循环。

图5.用于创建玻璃移液器的拉拔器
一旦生成，取玻璃移液管，并用25 G 1½针的注射器将其填充HBSS培养基。
将玻璃移液器安装到移液器支架上，并将其移动到目标下（图6）。

图6.装配到膜片钳装置的移液器支架的玻璃移液管应位于物镜和样品之间。红色圆圈表示玻璃移液器。
使用亮场照明来聚焦玻璃移液器的尖端。
同时向下移动移液管和显微镜的目标在z轴直到单层进入焦平面。不要让玻璃移液管在此阶段接触单层。
一旦单层聚焦，使用荧光检测中间残留物（图7; Video 2;Bernabé-Rubio等人，2016）。

图7.经受TUSP的细胞的代表性实例表达GFP-微管蛋白的MDCK细胞在落射荧光显微镜下实时成像。绿色箭头表示中部残留物。比例尺= 5μm
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视频2. TUSP程序的视频显微镜。将稳定表达GFP-微管蛋白的MDCK细胞进行TUSP。图像被实时捕获。 Brightfield和荧光通道被叠加显示。绿色箭头表示中间残留物的位置。

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选择一个中间体残留物进行清除，并使用明场照明将玻璃移液管慢慢移动到残留物。一旦彼此靠近，保持明场通道和荧光叠加。使用口通过管对吸液管施加负压，从细胞表面吸取中间体残留物（图1和7;视频2;Bernabé-Rubio等人，2016）。
在中间体残留去除后，在共聚焦显微镜下拍摄细胞，获取细胞的不同平面，以确保已经发生整个中间体的去除（图8;视频3）。

图8.通过TUSP去除表达GFP-微管蛋白的细胞的中间体残留。显示中等体的细胞在（前TUSP）之前和TUSP后（TUSP后）显示。请注意，残留物位于顶端表面。白色的箭头标记了中部残余物。由于细胞连续移动，所以在成像细胞场时，通常难以使多个细胞聚焦。圆圈表示经受TUSP的区域。注意，暴露于TUSP的细胞的中间体残留物被去除。比例尺= 10μm
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视频3.在前（TUSP前）和TUSP（TUSP后）稳定表达GFP-微管蛋白的MDCK细胞的Z-叠图像从基底外侧向顶膜显示图像（<即，从底部到顶部）。白色的箭头指向中部残余物。圆圈表示经受TUSP的区域。注意，完全去除了经受TUSP的电池的残余物。

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将细胞置于37℃的培养箱中，在含有5％胎牛血清，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM中，在5％CO 2/95％空气。
可以使用各种读数来使用适当的实验设置来评估中枢去除的可能的生物学效应。例如，我们已经使用荧光显微镜（Bernabé-Rubio等人，2016）研究了中间体残留物在初级细胞发生中的作用。

数据分析

可以使用中位体去除活细胞视频显微镜的影响进行定性分析。如前所述（Bernabé-Rubio等人，2016），该程序也可以用于定量地解决中间体去除后24小时不存在或存在的纤毛。细胞应在24小时后固定，并成像以检测纤毛的存在。在这种情况下，数据是分类的，因此在进行至少3次具有对照的实验重复之后，卡方分析是恰当的。

笔记

只要不存在细胞的光毒性/光漂白，该方案是高度可重复的，并且清楚地定义细胞图。建议短时间的照射时间以减少光毒性/光漂白。

食谱

HBSS介质填充膜片钳装置的腔室
汉克平衡盐溶液（HBSS），无酚红
20mM HEPE（pH 7.2-7.5）
50 U/ml青霉素，50μg/ml链霉素
0.5％胎牛血清
DMEM用于MDCK细胞培养 Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）
50 U/ml青霉素，50μg/ml链霉素
5％胎牛血清

致谢

我们感谢JoséA. Esteban博士（西班牙马德里的Centro deBiologíaMolecular Severo Ochoa）使用他的膜片钳设备。我们向Laura Rangel表示感谢，并收录了本协议中显示的一些照片，并记录了TUSP程序的视频。我们还要感谢Minerva Bosch-Fortea对协议的批判性阅读。直升机感谢Juan Bonifacino和Bonifacino实验室的支持，同时制定了该协议，Laura Pellegrini则严格阅读协议。感谢Centro deBiología分子Severo Ochoa的光学和共聚焦显微镜组的专家技术建议，非常感谢。这项工作得到了西班牙经济贸易大学/Fondo Europeo de Desarrollo区域（MINECO/FEDER）给M.A.Aonso的授权BFU2015-67266-R的支持。 Bernabé-Rubio先生是竞争力部长的研究员。

参考文献

BernardéRubio，M.，Andres，G.，Casares-Arias，J.，Fernandez-Barrera，J.，Rangel，L.，Reglero-Real，N.，Gershlick，DC，Fernandez，JJ，Millan，J. ，Correas，I.，Miguez，DG和Alonso，MA（2016）。通过极化上皮细胞在中枢体的初级细胞发生中的新作用。细胞生物学 214（3）：259-273。
Green，RA，Paluch，E.和Oegema，K。（2012）。动物细胞中的细胞因子。 Annu Rev Cell Dev Biol 28：29-58。
郭伟，TC，Chen，CT，Baron，D.，Onder，TT，Loewer，S.，Almeida，S.，Weismann，CM，Xu，P.，Houghton，JM和Gao，FB，Daley，GQ and Doxsey， S.（2011）。通过逃避自噬的中层积累有助于细胞重编程和致瘤性。 Nat Cell Biol 13：1214-1223。
Li，D.，Mangan，A.，Cicchini，L.，Margolis，B。和Prekeris，R。（2014）。有丝分裂期间的FIP5磷酸化可以调节顶端的运输和管腔发生。 15（4）：428-437。 />
Singh，D.和Pohl，C.（2014）。 28（3）：253-267。